肿瘤防治中噬菌体展示技术的应用范文

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《德州学院学报》2016年第4期

摘要：

噬菌体展示肽技术是一种特异性多肽筛选技术，它通过将随机序列的外源DNA片段定向插入至丝状噬菌体的相关基因后，相应的肽序会以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面．噬菌体和特异性抗原特异性结合后将其富集后便可准确认识与相应靶位相结合的多肽序列．近年来这种技术以应用到生命科学的多个领域，尤其在抗肿瘤研究过程中，这种技术可用于肿瘤标志物的筛选、肿瘤抗原抗体库的建立、多肽分子探针的筛选等领域．

关键词：

噬菌体展示肽库；肿瘤；肿瘤标志物；多肽分子探针

1引言

噬菌体展示技术是一种筛选与目标靶位特异结合多肽的生物技术．该技术由Smith等人［1］于1985年首创，最早发表于国际顶尖杂志《Science》．Smith等人在其论文中详细阐述了这一新的生物技术手段．当将外源DNA片段定向插入到丝状噬菌体的基因III后，相应的肽序列就会以融合蛋白的形式展示于衣壳蛋白表面．与特异性抗原进行亲和筛选后将其富集便可准确认识与靶位相结合的多肽序列．目前，随着生物技术的不断发展，该项技术已日趋成熟，也已经衍生出各种类型的筛选方法，并以用于各种类型的亲和筛选过程，也获得了较多具有较好特异性的多肽分子．

2噬菌体展示技术的基本原理

噬菌体展示技术是通过基因工程技术将一定长度的随机肽序列基因整合到噬菌体衣壳蛋白基因中，当基因表达后该多肽序列会和衣壳蛋白形成融合蛋白并将其展示于衣壳蛋白表面，从而使表型和基因型之间建立了联系．由于随机肽序列基因千变万化，因而展示到衣壳蛋白表面的展示肽序列也会呈现出各种序列结构，因此，也称之为噬菌体展示肽库．其基本操作程序为：首先将噬菌体肽库扩增，之后与固相化的靶蛋白共同孵育一段时间后，洗去未与靶分子结合的及亲和力较弱的游离噬菌体，然后以竞争性受体或酸液强力洗涤，洗去非特异结合的噬菌体颗粒后，将特异性结合的噬菌体颗粒扩增、滴定，进行下一轮洗脱，经3～5轮筛选后，与靶分子特异结合的噬菌体颗粒得到高度富集．之后以分子生物学手段测序后分析得到蛋白基序，之后用于下一步研究．

3噬菌体肽库技术用于肿瘤标志物的筛选

肿瘤表面标志物是一类重要的生物标记物，多数分布于肿瘤细胞表面或血液之中．因此，通过检测相应的肿瘤标志物就可以预知患者患癌的风险．在医学基础研究及临床研究过程中具有重要的意义．肿瘤标志物的筛选可以通过许多现代分析手段完成，如2D－PAGE、真核表达文库、原核cDNA文库等，其中噬菌体肽库展示技术是一种比较便捷的筛选方法［2］．以噬菌体展示肽库技术筛选肿瘤标志物的研究方向主要集中于以下两方面：首先是以固相筛选的方法获得与肿瘤细胞表面相关抗原相结合的特异性多肽分子，以化学手段将其与特殊的发光物质、荧光物质或放射性物质相偶联，利用特殊仪器有望用于肿瘤的早期诊断．另一方面，通过上述方法筛选到的多肽分子本身就是肿瘤细胞表面的某种特异配体，以这种特殊配体与相应的物质偶联可实现成像，用于肿瘤的早期诊断．DelcommenneM等人以多发性骨髓瘤细胞为靶细胞，利用噬菌体展示肽库技术筛选到与靶细胞特异结合的人单链可变区抗体片段scFvsD4A4和D6B10．利用该抗体片段可以方便地发现骨髓瘤细胞表面的硫酸乙酰肝素硫酸化，所以该抗体片段有望作为一种重要的肿瘤标志物用于该肿瘤的动态监测，为更好地实现诊疗奠定基础［3］．人的血清中有许多针对自身抗原的抗体，而针对肿瘤相关抗原的自身抗体可作为一类重要的生物标志物，通过血清学测试可以用来检测肿瘤的早期发生．具有重要的诊断价值．Kelly等人［4］通过建立胰导管癌老鼠模型，以体内筛选的方法获得了一个与人胰导管癌细胞表面抗原特异结合的多肽plectin－1，通过蛋白组学鉴定后表明该多肽为一重要的肿瘤标志物，有望可用于人胰导管癌的早期诊断．

4噬菌体展示多肽的筛选方法

在噬菌体展示技术筛选特异性多肽分子的过程中，这些肽分子可以通过一种被称为淘选的方法得以快速的筛选，经多轮淘选后，逐渐得到具有较强特异性的噬菌体克隆，最后经测序后得到噬菌体展示肽的共有序列，所得肽具有较好的靶向特异性而被广泛应用．最简单的淘选程序便是通过选择靶位、结合、洗涤、扩增直至鉴定．

4．1体外筛选

体外筛选是目前噬菌体展示技术最普遍使用的一种方法．筛选之前，靶标的确认及选择最为重要．通常情况下可以选择细胞、细胞表面的某些抗原、蛋白、蛋白受体甚至细胞内的某些重要靶点．得到靶标后，就可以通过选择合适的筛选体系进行筛选．如图1所示，在筛选开始之前首先要通过阴性吸附细胞将非特异性噬菌体排除，这样就可以减轻后续筛选的压力．经过第一轮后，较为特异的噬菌体颗粒得到进一步的富集．在接下来的几轮筛选过程中，还要逐步增加洗脱的力度如逐步加大洗涤的次数、增加洗涤的时间以及在洗涤液里加入Tween等表面活性剂．最终使得亲和力最强的噬菌体颗粒被筛选出来，这个过程被称作“生物淘选”．最终经过扩增、滴定等环节，就可以用于后续的鉴定性实验．体外筛选最主要的一种类型为全细胞淘选．这种方法需要通过常规手段培养细胞，获得靶细胞后就可以展开筛选．全细胞淘选最主要的特点就是细胞表面的抗原较多，因而就有可能获得较多特异性多肽分子．

4．2体内筛选

体内筛选一般要借助于动物模型．动物模型可以有效模拟活体环境，最大化地提高多肽分子与体内特定靶标的结合能力．最常用的方法是将噬菌体通过尾静脉注射使之在实验动物体内通过血液循环到达靶标部位，最终可以得到特异的噬菌体克隆．体内筛选最常用的动物模型为荷瘤裸鼠．首先将人源性肿瘤细胞通过皮下注射注入至裸鼠体内，待长出肿瘤块后，选择尾静脉注射方式将相应的噬菌体注入至裸鼠体内，经多轮循环最终会筛选到与肿瘤组织特异结合的噬菌体克隆．经后续扩增后进一步测序并获得其多肽序列．尽管人们普遍认为，体内筛选可以最大限度地模拟动物体内环境，因此所得的多肽分子的可开发利用价值最大．但是，体内筛选也存在一定的问题如［5］：①序列主要以RGDmotif序列为主．因为含有RGDmotif序列的多肽主要是结合于α&’3inte－grin．②筛选到的多肽主要结合于脉管系统，不会直接到达肿瘤组织．

5噬菌体展示技术在肿瘤防治中的应用途径

利用噬菌体展示技术可以筛选得到靶向特异性多肽分子，这些多肽分子与其它标记物分子偶联后，既可以利用其靶向性作用，也可以利用标记物分子显示人体内病灶部位．与药物分子偶联后，还有望实现肿瘤的靶向分子治疗，因此，具有较好的开发利用价值．

5．1噬菌体展示技术与肿瘤的分子影像学诊断

分子影像学是以现代生物工程技术为背景，在细胞和分子水平研究生命活动的规律的科学，在此技术上还可实现定性和定量的研究，以期了解相应分子的变化规律及其相互作用［6，7］．而分子影像学发展的最直接影响因素便是特异性较好的靶向分子探针的研究与开发［8，9］．利用噬菌体展示技术获得较好的靶向多肽分子的研究较多［10］．以微阵列方法筛选可以得到前列腺癌标志物hepsin（HPN），以此标志物为靶标，以噬菌体肽库技术筛选得到与其特异结合的多肽分子，这些多肽分子以化学方法与荧光纳米颗粒偶联后将其注入荷瘤小鼠体内，结果表明，该多肽分子可特异结合于病灶部位，利用相关仪器设备有望用于该肿瘤的分子影像诊断，具有较大的利用价值［11］．同样，Qi等人［12］将靶向多肽分子和一种特殊的化学发光物质ECL－PB偶联，通过特殊设备就可以特异地鉴定出人前列腺癌表面抗原．肿瘤的脉管系统对于肿瘤的增殖具有重要的生理意义，其内皮细胞上高度表达有许多特异的分子，通过该项技术可以筛选到的与这些分子特异结合的多肽分子，有望用于基础与临床研究．VPAC1受体是一个与血管生成密切相关的受体家族成员，研究表明，它的过度表达直接影响着恶性肿瘤的增殖与迁移活动．因此，如果以该受体为重要靶标，筛选与其特异结合的多肽分子，则有望用于该肿瘤的分子影像学诊断．Tang等人利用该技术筛选到一个VP－2肽，研究结果表明该肽能够与多种类型的结肠癌细胞受体特异结合．因此，标记后该肽有望作为一种重要的靶向分子探针应用于肿瘤的早期分子影像学诊断［13］．整合素是分布于细胞表面的一类异源多聚糖蛋白家族成员，它的存在直接影响着细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用．αvβ3整联蛋白是细胞膜上一个重要的膜受体蛋白，它扮演着多种重要的生理功能，如肿瘤的侵袭、肿瘤细胞的恶性增殖、转移以及血管的生成、炎症的发生、骨质疏松及风湿性关节炎等疾病的发生、发展．有报道表明，有一类重要的含有三肽基序Arg－Gly－Asp的多肽分子可以特异结合于αvβ3和αvβ6分子．而αvβ6是一种典型的蛋白分子，它在多种肿瘤中均高度表达，当将这些具有典型基序的多肽分子与同位素等标记物分子相偶联后，就有望作为一种重要的分子探针用于肿瘤的早期诊断［14］．CGLIIQKNEC是一个应用该技术筛选得到的多肽分子，研究表明它可以特异结合于纤连蛋白的环状多肽，当该肽与Gd－DTPA偶联后形成的复合物能够在肿瘤组织中高度富集，有望用于分子成像［15］．综上所述，靶向多肽分子可以作为载体分子，通过和某些影像标记物如荧光、放射性物质、纳米颗粒等结合后，在病灶部位就能够通过仪器检测到相应信号，应用于临床后有望用于靶向诊断和治疗［16］．因此，具有灵敏、便捷的特点．但是，由于肿瘤发生的复杂性导致所产生的标志物具有较大的可变性，与多肽分子有关探针也未见任何报道，因此对于这方面的研究还需继续深入研究，其可发利用空间巨大、前景诱人．相信随着基础医学及分子生物学技术的不断发展，多肽分子探针用以肿瘤的早期诊断可以变为现实．

5．2噬菌体展示技术与靶向药物的开发

一些大分子物质如抗体可以作为重要的抗肿瘤药物用于癌症的治疗和靶向药物分子的递送．但是抗体作为药物载体具有诸多不利条件．如：分子较大不易穿透肿瘤组织，另外，部分抗体还可引起较强的免疫反应，而且还会积累于肝脏和网状内皮组织系统［17］．靶向分子多肽是一类具有较强应用价值的分子，这种分子应用于药物开发主要通过以下两种方式：其一是利用它作为载体分子，将药物分子与其偶联后借助于多肽分子的靶向作用将其递送到相应的病灶部位，起到治疗作用．生腱蛋白是一类在肿瘤组织相关基质中高表达的特殊蛋白质．Kim等利用噬菌体展示技术获得了与该蛋白特异结合的多肽分子，研究结果表明，这种多肽分子具有较好的靶向特异性，有望作为一种重要的载体分子用于靶向药物治疗［18］．部分多肽分子除了具有较好的靶向作用外，还具有一定的抗肿瘤功效，一方面表现出细胞毒活性，另一方面，作为一种重要的调节物质作用于细胞的信号通路，通过促发某些重要蛋白和受体来促进细胞凋亡．有研究报道，多肽分子sp22是一个与CD95特异性结合的分子，研究结果表明，该分子不仅能够有效抑制CD95的表达，而且还能引起补体介导的细胞自溶以及启动凋亡信号促使细胞凋亡，在靶向药物开发方面具有重要意义［19］．靶向多肽HSQAAVP能够对成纤维生长因子8b诱导的细胞恶性增殖具有较强的抑制作用，其主要机理是通过通过抑制Cyc－linD1和PCNA进而产生周期阻滞效应，同时对于Erk1／2和Akt的级联效应也具有抑制作用．因此，该肽在前列腺癌的药物防治方面具有重要的开发价值［20］．PTPRJ是一个酪氨酸磷酸酶蛋白受体，在肿瘤组织中表达较少，PaduanoF等人［21］以噬菌体展示技术筛选到一个特异性多肽分子，该分子能够激活PTPRJ．研究结果表明，该激活肽能够显著降低培养细胞的MAPK磷酸化水平和酪氨酸水平磷酸化．而且能够促进细胞周期抑制剂P27的高表达．降低肿瘤细胞的恶性增殖并引起细胞凋亡．因此，该激活肽可以作为一种新的分子有望用于靶向治疗过程．当然，多肽分子抗肿瘤也存在一定的缺陷，多肽分子的稳定性较差，在生物体内容易被降解，但通过理化修饰便可获得较好活性的生物分子．Mier等人报道了一个利用噬菌体展示技术获得的多肽分子FROP－DOTA．将该肽与PEG偶联后，该肽稳定性进一步增强、在肿瘤组织中的积累增加，大大地提高了其可利用价值［22］．

作者:王瀚 赵淑玲 卓平清 单位:陇南师范高等专科学校生命科学与技术系