苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定范文

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《植物检疫杂志》2016年第一期

摘要

对来自美国的苹果进行了病原菌分离，结果在果实中分离到1株疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测，实验结果表明，菌株Nk-2968在PDA培养基上生长良好，能产生大量的分生孢子；经真菌通用引物（ITS4/ITS5）及β-tubulin引物分别扩增和测序，菌株Nk-2968与GenBank中登录号AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性达到100%；病菌接种苹果8d后开始发病。根据上述实验结果，将分离获得的菌株Nk-2968鉴定为苹果牛眼果腐病菌（Neofabraeakienholzii）。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。

关键词

苹果牛眼果腐病菌；形态特征；分子检测；致病性测定；鉴定

苹果牛眼果腐病菌，属于子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门，锤舌菌纲，柔膜菌目（Helo-tiales），皮盘菌科（Dermataceae），明孢盘菌属（Neo-fabraea）。无性世代为Cryptosporiopsiskienholzii。它与我国口岸多次在进境苹果中所截获的其他3种苹果牛眼果腐病菌（Neofabraeamalicorticis，N.perennans和N.alba）互为近似种。Neofabraeakienholzii在进境苹果果实上的截获尚属首次，是一种危险性的有害生物。苹果牛眼果腐病的病原菌以往一直被认为是Peziculaspp.，1999年起公认Neofabraea为病原菌的正确属，将Peziculaspp.归入Neofabraeaspp.［1］。苹果牛眼果腐病菌可侵染多种果树，如苹果、梨、杏、山楂、温桲、桃、唐棣（蓝莓）等。苹果中所有品种均感病，果实腐烂率可达40%。病菌不仅侵害苹果等果实，产生牛眼状的烂果，在储存期危害较重，病菌还可侵染树木的枝干和枝条而导致树皮发生溃疡，甚至枝条枯死，幼树死亡，故又称苹果树炭疽溃疡病菌和苹果多年生溃疡病菌。苹果牛眼果腐病菌主要分布在北美、欧洲（丹麦、荷兰、葡萄牙）、新西兰、澳大利亚等国家，我国未见该病菌的发生为害报道［2］。2015年8月，上海出入境检验检疫局植检实验室从美国进境的苹果果实上通过分离培养获得了一疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968，采用形态学特征、分子生物学检测和致病性测定等方法对其进行了种类鉴定，证实从苹果果实上分离到的菌株Nk-2968为苹果牛眼果腐病菌。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。

1材料与方法

1.1材料、试剂和仪器材料：病原菌分离材料为美国进境的苹果果实；致病性测定接种材料为健康苹果。试剂：植物总DNA提取试剂盒，PCR反应试剂，DL2000DNAmarker，琼脂糖，常规PDA培养基。仪器：超净工作台，立体显微镜），显微镜（ZEISSImager.M1），PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统。

1.2病原菌的分离培养与纯化用75%酒精消毒病果表面，在病健交界处挖取少许果肉置于PDA培养基上，于23℃黑暗条件下培养。观察病菌菌落的生长情况，对长出的菌落及时移取，置于新的PDA平板上纯化培养。

1.3病原菌形态鉴定分别观察和记录病菌菌落在PDA平板上的形态、颜色变化和气生菌丝的疏密程度。在立体显微镜和显微镜下分别观察病原菌在分离纯化培养过程中所形成的分生孢子，使用ZEISSAxioCamMRc5数码摄像头配合AxioVisionRel.4.5软件拍摄其形态并测量其大小，根据病菌的形态特征进行鉴定。

1.4分子检测

1.4.1菌丝DNA提取用灭菌挑针刮取PDA平板上培养7d的菌株菌丝体，按植物总DNA提取试剂盒说明书所述，提取该病菌的DNA，提取后将DNA保存于-20℃冰箱，备用。

1.4.2DNA扩增分别采用真菌通用引物ITS4/ITS5（上游引物为：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，下游引物为：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和根据β-tubulin基因设计的引物Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo（上游引物为：5'-CAACTGGGCTAAGGGTCATT-3'，下游引物为：5'-GTGAACTCCATCTCGTCCATA-3'）对菌株Nk-2968基因组DNA进行PCR扩增。反应体系为：10×buffer2.5μL、Mg2+2.0μL（25mmol/L）、dNTP0.5μL（10mmol/L）、上下游引物各0.5μL（20μmol/L）、DNA3μL、rTaq0.3μL（5U/μL），灭菌水补足至25μL。采用通用引物ITS4/ITS5的PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环的扩增；72℃延伸7min后，保存于4℃。采用引物Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo的PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环的扩增；72℃延伸7min后，保存于4℃。1.4.3PCR产物序列分析将所得PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行双向序列测定，对测序获得的序列进行拼接并在GenBank中Blast，进行序列分析。

1.5病菌的致病性测定选取20个健康无伤的新鲜苹果，先用75%的酒精对其进行表面消毒，然后在果皮部针刺出伤口，做好记号，再用灭菌挑针挑取适量PDA平板上纯化培养的菌丝，将其接种在伤口上，最后用无菌水接种作为对照。用湿润的灭菌脱脂棉覆盖住伤口，将接种后的苹果分别放入无菌塑料袋中，并放置在23℃黑暗条件下保湿培养。观察记录发病情况，并对发病果进行病菌再分离。

2结果与分析

2.1病原菌形态特征在23℃的培养条件下，菌株Nk-2968在PDA上培养5~6d后有乳白色的菌丝产生，菌落圆形，边缘较整齐，气生菌丝较少。后期，病菌的菌落颜色逐渐加深，背面呈橄榄绿色（图1：A）。将在PDA培养基上获得的纯化病菌置于黑暗条件下，13d后开始产生无色透明的大型分生孢子和小型分生孢子（图1：B）。大型分生孢子长椭圆形，大多直，个别稍弯曲，小型分生孢子长椭圆形。经过测量，大分生孢子大小为15.67~11.48μm×3.94~2.51μm，平均大小13.22μm×3.36μm；小分生孢子大小为7.04~4.51μm×3.11~1.93μm，平均大小5.8μm×2.23μm。

2.2分子测定及序列分析用真菌的通用引物ITS4/ITS5对菌株Nk-2968的DNA序列进行扩增，经双向测序和拼接，将其在GenBank中通过Blast进行比对。结果表明，菌株Nk-2968的核苷酸序列与已报道的苹果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）2个菌株的同源性最高，达到99%以上。从关系树上可以看出，菌株Nk-2968与N.kienholzii的2个菌株形成一簇，而与Neofabraea的其他近似种关系较远（图2）。用β-tubulin引物Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo对菌株Nk-2968的DNA序列进行扩增，经双向测序和拼接，将其在GenBank中通过Blast进行比对。结果表明，菌株Nk-2968的核苷酸序列与已报道的苹果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）的同源性最高，与其中的3个菌株（序列登录号：AF281462.1，HG793110.1和HG793112.1）的同源性达到100%。从关系树上可以看出，菌株Nk-2968与N.kien-holzii的3个菌株形成一簇，而与Neofabraea的其他近似种关系较远（图3）。

2.3致病性测定用菌株Nk-2968接种苹果，观察发病症状。结果表明，接种苹果果实8d后，接种部位开始出现褐腐症状，病斑边缘与健康组织界限清晰，随着接种时间加长，发病部位褐腐病斑逐渐扩大，腐烂加重。未接种病菌的对照则未出现上述症状（图4：A）。对上述接种病菌的苹果发病部位进行病菌再分离，结果分离后的病菌菌落性状与接种病菌的特征完全一致，即培养初期有乳白色的菌丝产生，菌落圆形，边缘较整齐，气生菌丝较少（图4：B）。致病性测定结果表明，该菌株可以侵染苹果果实。

2.4结论通过对苹果果实分离到的菌株Nk-2968的病原菌形态学观察、分子检测和致病性测定，认为2015年8月上海口岸从美国进境的苹果腐烂果实中分离的病原真菌Nk-2968为苹果牛眼果腐病菌（Neofabraeakienholzii）。

3讨论

N.kienholzii与2007年中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录中公布的检疫性有害生物Peziculamalicorticis（Jacks.）Nannfeld（即N.mal-icorticis）互为近似种，国内未见发生报道。国内外学者对该病菌研究得很少，一般主要研究的是Neo-fabraeamalicorticis，N.perennans和N.alba这3个种。由于N.kienholzii与上述3种已命名的苹果牛眼果腐病菌在病菌形态特征上较为相似，且该种的不同株系在病菌的培养性状上也存在较大差异，因此，直到2009年，Robert等才命名了这个新种Cryptosporiopsiskienholzii（有性型为Neofabraeakienholzii），并较为详细地报道了N.kienholzii的菌落特征、分生孢子的形态和大小等［3］。本研究中分离到的菌株Nk-2968的菌落特点及孢子大小、形态等，与该报道结果基本一致。本研究采用病原菌形态学结合分子检测和致病性测定的方法，分离并鉴定了美国进境的苹果果实中所携带的苹果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）。本实验用真菌通用引物ITS4/ITS5对菌株Nk-2968的DNA进行PCR扩增及对产物进行双向测序拼接后，发现所得序列与N.kienholzii及其近似种的序列同源性均可达到99%，无法有效区分。国内外相关文献中也有报道，由于Neofabraeaspp.的ITS区序列相似性高，有时难以用该区段的核苷酸序列来鉴别不同的种［4］。为此，国外学者James研究了该属β-tubulin基因序列，发现在该保守区段内，Neo-fabraeaspp.种与种之间的差异更明显［5］。本实验采用根据β-tubulin基因设计的引物对菌株Nk-2968的DNA序列进行扩增、测序。序列分析结果表明，该菌株与GenBank中的N.kienholzii序列同源性可达100%，进一步确认了病原菌形态学的鉴定结果。致病性测定结果表明，该菌株能够侵染苹果果实。以上实验结果均支持将此菌株鉴定为苹果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）。此为全国首次从国外进境的苹果果实中截获该危险性有害生物。

苹果牛眼果腐病菌可侵染多种果树，它不仅侵害果实，还可侵染树木的枝干和枝条，导致树皮发生溃疡，甚至是枝条枯死，幼树死亡。而苹果牛眼果腐病菌对气候条件的适应性强，可通过水果贸易和苗木调运进行异地及跨国传播，储运期间冷藏温度下病菌仍能扩展。一旦该病菌随苹果果实传入我国，其定殖传播为害的风险性较高，将会对农林业和果树生产造成难以估量的损失。因此，对于来自疫区的寄主植物的苗木、枝条、叶及果实等，应当给予高度重视，并且加大查验力度，防止苹果牛眼果腐病菌的传入，保护我国的农林业安全生产。

作者：张露茜 胡培龙 李薇 于子翔 焦彬彬 易建平 于翠 杨翠云 单位：上海出入境检验检疫局