柑橘黄化脉明病毒检测方法的应用范文

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《植物保护学报》2016年第二期

摘要:

为探索柑橘黄化脉明病毒引起的柑橘新病害—柑橘黄脉病的早期快速检测技术，针对CYVCV核酸结合蛋白基因的保守序列设计2对特异性引物，通过优化退火温度，建立了CYVCV巢式RT-PCR检测方法，并对采自不同柑橘品种的54个CYVCV疑似样品进行了检测。结果表明，CYVCV巢式RT-PCR检测中，以55℃和60℃分别作为第1轮和第2轮扩增的退火温度时检测效果最佳;该方法检测样品中病毒总核酸的最低浓度为2.40μg/L，灵敏度较RT-PCR提高100倍。在CYVCV疑似样品检测中，巢式RT-PCR和RT-PCR的阳性检出率分别为59.26%和57.41%，前者更适用于检测不同来源的CYVCV。当尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑嫁接接种CYVCV后，巢式RT-PCR比RT-PCR提前10～30d检测出病毒。表明所建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法适用于田间病树的早期诊断。

关键词:

柑橘黄化脉明病毒;巢式RT-PCR;检测

柑橘黄脉病是由柑橘黄化脉明病毒引起的一种新的柑橘病害。该病最早发现于巴基斯坦，随后在印度、土耳其、中国等国家相继被报道。该病能够危害大多数柑橘种类，其中柠檬和酸橙对此病最为敏感，甜橙较为耐病，宽皮柑橘、葡萄柚、香橼和墨西哥莱檬等最为耐病。植株感染此病后叶脉黄化、透明，叶片脱落，产量降低，甚至绝收(Cataraetal．，1993;nelgeetal．，2010)。目前该病已对我国柑橘产业，尤其是柠檬生产造成了严重损失，且发生范围逐渐扩大(周常勇等，2013;陈洪明等，2015)。CYVCV为柑橘病毒属Mandarivirus成员，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为670～700nm×13～14nm。CYVCV基因组含有7529个核苷酸，可能包含有6个开放阅读框。CYVCV除可以通过嫁接传播外，还能通过豆蚜A-phiscraccivoraKoch和绣线菊蚜A．spiraecolaPatch在柠檬和菜豆间进行传播(nelgeetal．，2011)，因此，豇豆、菜豆、辣椒、藜麦等也是柑橘黄脉病的草本寄主。但目前尚不清楚CYVCV是通过何种媒介昆虫在柑橘间进行传播，通过防治媒介昆虫来防控柑橘黄脉病尚不可行。柑橘黄脉病是我国新生病害，目前尚缺乏有效防治该病的药剂，因此种植无病毒苗木和加强病毒检测成为防治该病的重要途径，建立快速、灵敏的病毒检测技术是当前柑橘黄脉病防治的首要任务。CYVCV的检测鉴定通常以柠檬和酸橙作为指示植物，但检测周期长，需2～3个月，且需要进行隔离处理。Cataraetal．(1993)曾通过电镜技术检测CYVCV，但操作较为繁琐，且仅适用于部分柑橘品种的检测。近年来，Alshamietal．(2003)和Chenetal．(2014)相继建立的血清学和RT-PCR检测方法，缩短了CYVCV的检测时间。但对大量CYVCV疑似样品进行检测时，这些方法在灵敏度和检测范围上存在不足。因此，本研究通过建立CYVCV的巢式RT-PCR检测方法，以期进一步提高检测范围和准确性，以满足当前柑橘生产中CYVCV快速检测的需要。

1材料与方法

1.1材料供试毒源及植物样品:感染了CYVCV、柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑橘鳞皮病病毒、柑橘黄龙病的病株，2年生无病毒尤力克柠檬Citrusli-mon、锦橙C．sinensis北碚-447、天草C．reticulata×C．sinensis和台湾椪柑C．poonensis实生苗，以及柑橘溃疡病的总核酸提取物均由西南大学柑橘研究所脱毒中心提供。所有植物分别置于不同的20～25℃隔离温室中生长备用。供试54份疑似样品采自四川、重庆、云南、江西、湖南、福建等地的甜橙、柚、宽皮柑橘、杂柑、柠檬、葡萄柚和枳类等柑橘上。

引物:根据GenBank中CYVCV土耳其分离株Y1(JX040635.1)的基因组序列，针对其3'端保守的核酸结合蛋白基因运用Oligo6.0生物学软件设计2对引物。其中外巢引物中上游引物为CYVCV-1f:5'-ATCATGAGTTCCATACCACTCGAG-3'，下游引物为CYVCV-1r:5'-AAATATTCAGGCTTTCAGTTT-3'，预期扩增片段长度为704bp。内巢引物中上游引物为CYVCV-2f:5'-AAACCTAATCGGTCCTGTG-3'，下游引物为CYVCV-2r:5'-GAGACACCCTACTTCAGCG-3'，预期扩增片段长度为469bp。Chenetal．(2014)建立的RT-PCR所用上游引物为VF-1:5'-TACCGCAGC-TATCCATTTCC-3';下游引物为VR-1:5'-GCAGAAATC-CCGAACCACTA-3'。所有引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。培养基及试剂:LB(Luria-Bertani)液体培养基:1%氯化钠、0.5%酵母提取液、1%蛋白胨。Prim-Script1StepEnzymeMix、ExTaqDNA聚合酶、胶纯化试剂盒、pMD19-T载体、感受态细胞JM-109和质粒纯化提取试剂盒等均购于宝生物工程(大连)有限公司;限制性内切酶XmaI和HindIII购于美国NEB公司;SephadexG-50-80购于美国GEHealth-care公司;其余试剂均为国产分析纯。仪器:VarioskanFlash核酸读数系统，美国ThermoScientific公司;TGRADIENT型PCR仪，美国WhatMan公司。

1.2方法

1.2.1CYVCV病毒总核酸的提取选取5～10mgCYVCV病株的叶片，液氮中研磨后加入60μLTES缓冲液和60μL饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。混匀后70℃水浴5～10min。将上清液用由SephadexG-50-80构成的微柱过滤后在－20℃保存备用(周常勇等，2001)。1.2.2退火温度的优化第1轮RT-PCR扩增:将1μLCYVCV病株的总核酸与1μL无菌水混合，95℃解链3min，冰浴后依次加入5μmol/L外巢引物CYVCV-1f/CYVCV-1r各0.5μL、2×1StepBuffer5μL、PrimScript1StepEnzymeMix0.4μL，无菌水补足至10μL。反应条件为:50℃30min，94℃2min;94℃30s，退火(温度设置49、51、53、55、57、59℃)30s，72℃45s，循环15次;72℃延伸5min。第2轮PCR扩增:取1μL第1轮扩增产物，依次加入5μmol/L内巢引物CYVCV-2f/CYVCV-2r各1μL、10×PCR缓冲液2.5μL、5U/μLExTaqDNA聚合酶0.2μL，无菌水补足至25μL。反应条件为:94℃2min;94℃30s，退火(温度设置56、58、60、62、64、66℃)30s，72℃45s，循环30次;72℃5min。

1.2.3巢式RT-PCR扩增产物的检测及鉴定将巢式RT-PCR扩增产物的目的片段切胶纯化回收后与pMD19-T载体于4℃连接过夜，并转化感受态菌株JM-109。挑取单个的转化菌落，加LB液体培养基培养24h后用质粒纯化提取试剂盒提取质粒DNA。质粒DNA经限制性内切酶XmaI和HindIII双酶切鉴定后，将阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序鉴定。测序结果与CYVCV土耳其分离株Y1(JX040635.1)的相应序列进行BLAST比对分析。

1.2.4巢式RT-PCR特异性及灵敏度检测按照1.2.1的方法分别提取感染了CTV、CTLV、SDV、CEVd、CPV、CYVCV和HLB的病株的总核酸，并将其与本课题组保存的溃疡病总核酸用已建立的巢式RT-PCR方法进行检测。按照1.2.1方法提取黄脉病病株样品的总核酸，使用核酸读数系统测定其A260/A280比值和总核酸浓度。用无菌水按10倍梯度将获得的总核酸稀释至107倍，并以此为模板，分别按照上述的巢式RT-PCR，以及Chenetal．(2014)建立的RT-PCR方法进行检测。

1.2.5巢式RT-PCR和RT-PCR检测效果比较采用RT-PCR和巢式RT-PCR法分别检测采自甜橙、柚、宽皮柑橘、杂柑、柠檬、葡萄柚和枳类等柑橘上的54个CYVCV疑似样品。为保证检测的可靠性，每种方法均以CYVCV病株和健康植株作为正负对照。将检测结果不一致的样品嫁接接种于2年生无病毒尤力克柠檬实生苗，置于25～28℃隔离温室中保存。接种2～3个月后观察新梢症状。选取CYVCV分离株AY1分别嫁接接种于2年生无病毒的尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑。每个品种嫁接10株，每株嫁接2块皮和1个芽。嫁接后置于25～28℃隔离温室保存。嫁接后每10d提取1次总核酸，总共提取8次。每次按照周常勇等(2001)的方法从4个方向提取叶片中的总核酸，并将同一植株4个方向提取的总核酸混合后分别进行巢式RT-PCR和RT-PCR检测。

2结果与分析

2.1退火温度的优化及扩增产物的鉴定第1轮RT-PCR扩增中，退火温度为49、51、53、55、57℃时均能扩增出704bp的目标片段，但57℃时目标片段较弱，因此选用55℃作为最佳退火温度。第2轮扩增中，退火温度为56、58、60、62、64、66℃时均能扩增出469bp的目标片段，除62、64、66℃时扩增的条带亮度较弱外，其余条带亮度基本一致，且在58℃和60℃时没有出现非特异性扩增，因此选用60℃作为第2轮最佳退火温度。获得的质粒DNA经双酶切鉴定后，与预期大小相符。阳性菌液的测序结果经BLAST比对分析表明，插入片段与CYVCV毒株Y1(JX040635.1)序列相似性为100%。表明该扩增产物为CYVCV。

2.2巢式RT-PCR特异性检测建立的巢式RT-PCR方法能从来自柑橘黄脉病样品的总核酸中扩增出469bp的特征条带。该方法在检测来自柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病和黄龙病病株的总核酸，以及保存的溃疡病菌总核酸时均不能产生特征条带(图1)。

2.3巢式RT-PCR灵敏度检测提取样品总核酸的A260/A280平均值为1.93，其浓度为239.71mg/μL。检测结果显示，巢式RT-PCR能够检测到105倍稀释的模板，浓度约为2.40μg/L。RT-PCR能够检测到103倍稀释的模板，浓度约为240μg/μL，表明巢式RT-PCR检测灵敏度较RT-PCR提高了100倍(图2)。

2.4巢式RT-PCR和RT-PCR检测效果比较RT-PCR从54个疑似样品中检测出了31个阳性样品，巢式RT-PCR不仅能检测出这31个阳性样品，还从1个椪柑疑似样品中检测出了CYVCV，2种方法的阳性检出率分别为57.41%和59.26%。将RT-PCR未检测出的椪柑疑似样品嫁接接种于无病毒尤力克柠檬3个月后，其新梢表现出典型的脉明、黄化症状，证实该样品感染了CYVCV。将CYVCV分离株AY1嫁接接种于不同的柑橘品种后20d，运用巢式RT-PCR均可检测出CYVCV。在接种30d后，RT-PCR方可在尤力克柠檬和锦橙北碚-447上检测出CYVCV，直至接种50d后，RT-PCR才能在台湾椪柑上检测出CYVCV。相比RT-PCR，巢式RT-PCR在检测出CYVCV的时间上提前了10～30d(表1)。

3讨论

柑橘黄脉病是近年来我国出现的一种柑橘新病害，目前尚缺乏有效的防治方法，对柑橘黄脉病的早期诊断以及对采穗母树的监测是保证柑橘安全生产的重要措施，因此快速、准确、灵敏的检测方法显得尤为重要。而当前通过指示植物鉴定(Cataraetal．，1993)、血清学分析(Ahlawat＆Pant，2003)、电镜观察(Grimaldi＆Catara，1996)等方法进行柑橘黄脉病检测时，操作繁琐且检测周期长。Chenetal．(2014)建立的RT-PCR方法虽然极大地缩短了检测时间，但是本研究结果显示，在检测椪柑等耐病的柑橘品种时，尤其是在植株感染CYVCV的初期，RT-PCR在检测灵敏度等方面还存在不足。相较于常规RT-PCR，巢式RT-PCR因具有更高的检测灵敏度和特异性，近年来被广泛运用于柑橘病毒病的检测。本研究建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法，可从浓度约为2.40μg/L的总核酸模板中特异性检测出CYVCV，其灵敏度较RT-PCR提高了100倍。这与巢式RT-PCR在检测其它柑橘病毒病时表现相似，如宋震等(2011)建立的巢式RT-PCR可检测出浓度为1.27μg/L总核酸中的CTLV，其灵敏度较一步法RT-PCR提高了100倍;刘永清等(2010)和Adkar-Purushothamaetal．

(2011)报道，CTV巢式RT-PCR检测方法的灵敏度与实时RT-PCR相当，达13～14拷贝/μL。虽然巢式RT-PCR通过2次PCR扩增提高了检测的灵敏度，但是因为在第2轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，增加了发生非特异性扩增的机率，从而对检测结果造成严重干扰。为此，本研究通过提高第2轮PCR扩增时的退火温度，消除了非特异性扩增的产生，从而保证了检测的准确性。在对54份田间疑似样品进行检测时发现，巢式RT-PCR不仅可识别所有RT-PCR检测为阳性的样品，还可以检测出1份RT-PCR检测为阴性、但经指示植物鉴定确认感染了CYVCV的椪柑样品，因此巢式RT-PCR更适用于检测不同来源的CYVCV株系，且其准确性高于RT-PCR。此外，在进一步检测接种了CYVCV的尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑中发现，巢式RT-PCR比RT-PCR可提前10～30d检测出病毒，极大地缩短了田间样品检测时的“窗口期”，从而为柑橘黄脉病的早期监测、预警以及有效防控提供了重要的技术保障。

作者：周彦 陈洪明 王雪峰 李中安 王亮 周常勇 单位：西南大学柑橘研究所 四川省安岳县柠檬科学技术研究所