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《浙江林业科技杂志》2014年第二期
1材料和方法
1.1试验材料和标准品试验样本为2009年春季收集的不同产区的84个取样点的龙井茶样品，共527个。按照GB/T18650-2008的规定，其中西湖龙井一级保护区茶样（XHLJ1）174份，来自一级保护区内龙井村、梅家坞等10个自然村的27个取样点；西湖龙井二级保护区茶样（XHLJ2）56份，来自二级保护区的10个取样点；钱塘龙井茶样（QTLJ）137份，来自钱塘产区5个县的20个取样点；越州龙井茶样（YZLJ）160份，来自越州龙井产区6个县的27个取样点。为减少样品采摘期对龙井茶产地判别的干扰，从同一采样点，收集采摘前期、中期、晚期的相同原料品种的龙井茶样各1个，其中一个来自春茶开采后约第5天，一个来自开采后约第15天，另一个为第25天。样本的原料品种为无性系品种龙井43（LJ43）和有性群体种（POPN）。儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和咖啡碱（Caffeine,CAF）等标准品购于Sigma公司。
1.2样品测定称取3.000g（粉碎）干茶样，用50%甲醇室温提取15min后过滤。残渣洗涤3次，合并滤液，定容到100mL。液相色谱分析采用安捷伦1100HPLC系统，4μmPhenomenexRP-MAXC12反相柱，型号规格为250mm×4.6mm，柱温40℃；A相为1%甲酸；B相为乙腈；梯度从4%B到25%B，流速1mL/min，洗脱60min，检测波长280nm[25]。
1.3数据处理咖啡碱、C、EGC、EC、EGCG、GCG和ECG等组分通过与标准品的比较确认。其他未得到辨认的酚性化合物和生物碱，通过比较保留时间和相对保留时间进行匹配。去除掉一些不够稳定的小峰后，共保留26个HPLC峰用于分析。数理统计、主成分分析和线性判别分析采用SPSS软件进行；在线性判别分析中，对每类样本采取随机取二留一的方法划分训练集和验证集。
2结果与分析
2.1不同产区龙井茶HPLC化学图谱相似度分析西湖龙井一级保护区（XHLJ1）、西湖龙井二级保护区（XHLJ2）、钱塘产区（QTLJ）和越州产区（YZLJ）4个产区样品的26个面积较大的HPLC共有峰的峰面积平均值和标准差见表1。SPSS的ONE-WAYANOVA检验表明，在α=0.05水平下，不同产区龙井茶儿茶素等酚性化合物与生物碱HPLC含量在同一水平，没有显著性差异。4个产区龙井茶HPLC组份的欧氏距离见表2。从表2可以发现，XHLJ1和XHLJ2之间的欧氏距离最大，QTLJ和YZLJ之间的欧氏距离最小。4个产区龙井茶HPLC组份的欧氏距离和地理距离不一致，XHLJ1和XHLJ2之间的地理距离最近的，而欧氏距离却最大。
2.2龙井茶的主成分分析对龙井茶的HPLC化学组分数据进行主成分分析，共提取出5个主成分（表3），累计贡献率为94.2%，其中前两个主成分的贡献率分别为48%和23%（表3）。从表3可以发现，第一主成分（PC1）的构成中，对主成分得分值影响较大的因子按系数大小降序为EGCG、EGC、P11、C、CAF和EC，体现了几种主要儿茶素单体成分的影响力；在第二主成分（PC2）的主要构成中，影响大小依次为ECG、P20、CAF、P3和P16，主要包含的是一些洗脱时间较长的组分。以各样本第一、第二主成分得分值分别作为X坐标和Y坐标作图（图1），发现龙井茶按照品种的不同聚成两个集团，龙井43品种样本（LJ43）主要位于左上方，而群体种样本（POPN）主要位于右下方（图1A），说明原料品种是影响龙井茶内含成分关键性因素之一。但是，按照各样本的第一、第二主成分得分值，未能将不同产地龙井茶分开（图1B）。
2.3不同产区龙井茶的线性判别线性判别分析首先将分析样本分为训练集和验证集两部分，先用训练集样本建立判别模型，然后将训练集中的样本每次轮流抽走一个后重新建模，来判定建立的判别模型的稳定性，最后用验证集样本来验证判别模型的适用性和正确率。对试验数据进行线性判别分析，得到3个判别函数，其函数系数矩阵见表4。判别分析的结果表明（表5），117个西湖龙井一级保护区（XHLJ1）训练集的建模样本中，106个分类正确，10个被划分为越州龙井，1个被误判为钱塘龙井；交叉验证的数据基本一致；而57个验证集样本，49个判定为XHLJ1，8个判定为YZLJ。在西湖龙井二级保护区（XHLJ2）的训练集及其交叉验证中，均有三分之一左右的样本被认定成钱塘龙井（QTLJ），验证集中更有近一半的样本被认定成QTLJ。至于QTLJ，无论是训练集还是其交叉验证，或者是外部验证，都有20%~30%的样本被分类成其他几种类别。而YZLJ是判别正确率最高的一类，无论哪种情况，只有少量的样本被判定到XHLJ1或QTLJ中。以各样本的判别函数值作图，在前两个判别函数值FUN1和FUN2的投射平面（图2A）上，XHLJ1位于左上，YZLJ位于左下，而XHLJ2和QTLJ重叠在右边；在FUN1和FUN3组成的投射平面上（图2B）可以看到，XHLJ1集中于最左边的小块区域内，YZLJ则更靠右一点，而XHLJ2在右侧集中于上部，而QTLJ较零落地分布在右下部。
3讨论
由于不同加工工艺、原料嫩度对茶的品质成分有很大影响，因此不同种类茶的HPLC图谱有较大的差异性,往往比较容易进行区分。而不同产区龙井茶及以龙井茶加工工艺制成的其他扁形茶，因其原料嫩度要求一致、加工工艺相同，其化学组成及HPLC图谱的相似度很高,更难对同一茶类进行产区判别。本研究也发现，不同产区龙井茶在儿茶素、咖啡碱等化学成分的含量上没有显著性区别，而且HPLC图谱的相似度高。进一步的主成分分析结果表明，茶叶中最重要的几类儿茶素单体是构成第一、第二主成分的主要因子。根据前两个组分得分值，相同原料品种的龙井茶样本聚在一起。这一结果进一步验证的就是这样一个事实：由于遗传基础的不同，不同茶树品种所具有的特有的生化成分比例，可以影响成品茶的品质风味。因此，为了得到稳定的产品品质和特色，除加工工艺外，鲜叶原料也应该采用固定的茶树品种或固定的品种搭配比例。这也说明，原料品种会对茶叶产区判别带来较大的干扰。此外，从不同产区龙井茶的欧氏距离结果可看到，地理距离最近的二级保护区的西湖龙井茶与一级保护区的西湖龙井茶之间的欧氏距离最大；而且在判别分析中，一级保护区与二级保护区的西湖龙井茶之间没有误判。这一结果说明，在被研究的几类茶产品中，二级保护区的西湖龙井茶与一级保护区西湖龙井茶差异最大。相反，地理距离较远的越州龙井与西湖龙井一级保护区间的欧氏距离反而最为接近，两者间的互相误判也相对较多。对这一结果的解释，仅仅考虑地域分布是不够的，可能需要从历史传统和加工技术细节等各方面来加以分析。西湖龙井二级保护区历史上几乎都是生产旗枪茶的，20世纪90年代以后才开始转产龙井茶，直到本世纪初才正式划入西湖龙井产区。旗枪茶与西湖龙井茶外形比较相像，都属于扁形茶，但旗枪更为细长一些，加工工艺上，都有“青锅”和“煇锅”两个工序，但旗枪以前还有“挺锅”工序。这两类茶产品虽然挺类似，但风格特征上仍然存在差异。这些工艺上的风格和习惯，在转产龙井茶并划入龙井产区后，不可避免的还会有一定程度的留存和影响，因此可能是造成这两个产区产品之间存在一定差异的原因之一。而越州产品的龙井茶生产主要来自于上世纪90年代对西湖龙井历史产区的学习和模仿，没有历史工艺的干扰和影响，因此可能在与西湖龙井一级保护区产品的区分上更为困难一些。本文采用代谢组学原理和模式识别技术研究了龙井茶4个不同产区产品间的相似性和加以鉴别的可行性，虽然这一方法还不能正式用于茶产品产地的鉴别，但是在对于茶学研究中新思维和新技术手段的引进，对于现在越来越多的茶叶地理标志产品认定科学依据的探索，都有良好的推动作用。
作者：王丽鸳成浩贺巍韦康张成才单位：中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心 河南农业大学园艺学院