金华猪和长白猪ampk基因的研究范文

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《中国畜牧杂志》2014年第十期

1材料与方法

1.1实验材料选取不同生长阶段30、90、150d去势金华公猪和长白公猪各4头，共24头。屠宰后取猪皮下脂肪组织，投入液氮中迅速冷冻，-80℃冰箱保存。

1.2仪器和试剂ABISteponePlus实时荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）；NanoDrop2000（ThermoFisher，美国）；SYBRPremixExTaqTM荧光定量试剂盒（TaKaRa，大连，中国）；96孔定量PCR板（PCR-96-FLT-C）和封板膜购自ABI公司（ABI公司，美国）；RNA提取试剂盒（TrizolReagent）购自lnvitrogen公司（InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA，美国），反转录试剂盒购自Thermo公司（ThermoFisher，美国）；DEPC水及其他生化试剂购自上海生工生物工程技术有限公司。

1.3组织总RNA的提取及反转录利用TrizolReagment（Invitrogen公司）的操作说明进行脂肪组织总RNA的提取。利用NanoDrop2000超微量分光光度计进行RNA的浓度和纯度测定，检测260nm和280nm下光度A值，并计算OD260/OD280的值，此值在1.9~2.0说明提取的RNA的质量纯度较高。并进行RNA变性凝胶电泳检测鉴定RNA的完整性后，按照反转录试剂盒说明进行反转录获得cDNA。

1.4荧光定量PCR检测

1.4.1引物设计与合成ampkα1、AMPKα2、ATGL、HSL、ACC和CPT-1基因的荧光定量PCR引物序列的设计合成，18SrRNA基因引物序列参照Cheung等设计合成见表1。

1.4.2荧光定量PCR特异性检测利用ABISteponePlus实时荧光定量PCR仪比较金华猪和长白猪皮下脂肪中AMPK及相关基因的表达差异。荧光定量PCR反应体系（20μL）：10.4μLSYBRPremixExTaqTM（2x）mix，1.0μLcDNA，7.8μL无酶H2O，上、下游引物各0.4μL。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火和延伸34s并采集荧光信号，共40个循环；按仪器操作说明选择熔解曲线分析，60℃升至95℃，60℃保温1min，95℃保温15s，自动采集荧光。

1.5统计分析AMPKα1、AMPKα2、ACC、CPT-1、ATGL和HSL基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算，以18S作为内参基因，以金华猪脂肪组织中的基因表达作为参照，所得结果即为目的基因在长白猪中的表达相对于金华猪的倍数。统计学分析采用SPSS16.0中One-WayANOVA进行统计学分析，结果均以平均值±标准误表示。

2结果

2.1金华猪和长白猪由图1可见，AMPK基因的表达差异金华猪和长白猪AMPKα1和AMPKα2基因表达基本一致。30d金华猪AMPKα1和AMPKα2的mRNA表达水平极显著低于长白猪（P<0.01）；90d金华猪AMPKα1的mRNA表达水平低于长白猪（P>0.05），金华猪AMPKα2的mRNA表达水平显著高于长白猪（P<0.05）。150d金华猪AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表达水平均显著高于长白猪（P<0.05）。

2.3金华猪和长白猪AMPK下游相关基因的表达差异30d和90d，金华猪ACC基因表达水平均极显著高于长白猪（P<0.01）；150d，金华猪ACC的表达略低于长白猪，差异不显著（图2）。CPT1的表达受到ACC的抑制，与ACC相反，30d和90d金华猪脂肪组织中CPT1的表达分别极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）低于长白猪，150d金华猪高于长白猪（P<0.01）（图3）。脂肪分解关键酶ATGL和HSL的基因表达与AMPK基因表达差异相似，30d金华猪均极显著低于长白猪（P<0.01），90d金华猪低于长白猪，150d金华猪基因表达均极显著高于长白猪（P<0.01）（图4、5）。

3讨论

3.1不同日龄的金华猪和长白猪AMPK基因的差异AMPK是由α功能亚基和β、γ调节亚基构成的异源三聚体，且每种亚基都有2~3个亚型，使得其调节功能表现出组织的多样性。α亚基作为功能亚基，在AMPK调控过程中发挥着重要的作用。在脂肪组织中AMPK可以促进脂肪的分解和脂肪酸的氧化，抑制脂肪的合成。AMPK基因在不同品种猪脂肪组织中的研究鲜见报道。对于AMPK的研究也主要集中在骨骼肌和肝脏组织中。本实验结果表明，肉脂型金华猪和瘦肉型长白猪脂肪组织中AMPKα1和AMPKα2表达规律存在显著差异。本课题组前期研究结果也表明，金华猪体脂沉积主要在机体发育前期，而长白猪在生长发育后期才出现较快的体脂沉积。与金华猪、长白猪体脂沉积规律一致。金华猪皮下脂肪中AMPK基因表达在生长前期（30d和90d）低于长白猪，有助于机体进行脂肪合成和脂肪沉积，而生长后期（150d）AMPK基因表达金华猪高于长白猪，金华猪在进行长期的脂肪沉积后，整体的脂肪代谢可能保持在较高水平，脂肪代谢较旺盛。AMPK差异表达结果提示，AMPK在猪脂肪组织的脂肪代谢过程中发挥着一定的作用。

3.2金华猪和长白猪AMPK下游相关基因的表达差异AMPK对脂肪沉积的影响主要通过下游相关基因实现。有研究表明，在脂肪组织中，AMPK能够通过磷酸化抑制ACC的活性或者通过长时调节，降低ACC的基因表达，抑制脂肪酸的合成。ACC的抑制使得丙二酰辅酶A（MCoA）含量减少，进而减轻了对CPT-1的抑制，使其氧化分解供能增强。地方品种猪肝脏组织的脂肪合成能力显著高于地方品种猪，而对于地方品种猪脂肪组织的研究未见报道。本实验中，在低日龄时，AMPK在金华猪脂肪组织中的表达显著低于长白猪，与此相反，其下游的ACC的表达显著高于长白猪，而下游CPT-1基因的表达表现出金华猪显著低于长白猪。可能由于AMPK对ACC的抑制作用，使得CPT-1在长白猪脂肪组织中的抑制作用得到缓解，表达升高。AMPK下游基因ATGL、HSL的表达规律与AMPK相一致，提示AMPK可能调控ATGL和HSL，从而整体上调控脂肪代谢过程。在生长发育的早期，金华猪脂肪组织中脂肪分解和脂肪酸氧化相关基因的表达较低，提示金华猪在发育早期就开始进行大量的脂肪合成。到了生长发育后期，长白猪脂肪组织中脂肪分解和脂肪酸氧化相关基因表达相对较高，提示长白猪在发育后期才开始进行大量的脂肪合成，而金华猪则表现出比较旺盛的脂肪代谢。AMPK下游基因的表达差异提示，AMPK对于脂肪代谢的影响可能是通过提高脂肪分解过程来实现的，这与最近的研究成果相一致。

4结论

本研究结果表明，不同日龄金华猪和长白猪脂肪组织中AMPK基因表达存在品种差异。AMPK下游脂肪代谢相关基因在两品种猪之间也存在显著差异。AMPK可能通过调控下游脂肪代谢相关基因影响猪体脂沉积。

作者：余秀锋任阳黄晶汪以真单位：浙江大学饲料科学研究所生物饲料安全与污染防控国家工程实验室农业部饲料与动物营养重点开放实验室浙江省饲料及动物营养重点实验室