硫酸阿米卡星的药代动力学范文

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《畜牧与兽医杂志》2014年第六期

1材料与方法

1.1试剂及溶液硫酸阿米卡星注射液来自于上海恒丰强动物药业有限公司，批号为20121101;甲醇、乙腈(CNW公司)为色谱纯;有机相针式滤器(0.45μm，CNW公司);WhatmanNo.4滤纸、GF/C玻璃纤维滤纸(上海利根商贸有限公司);进样瓶(CNW公司)。四硼酸二钠缓冲剂:3.8g四硼酸二钠溶于80mL蒸馏水中，用NaOH调pH至10.38后定容至100mL棕色容量瓶中，使用前用0.45μm的有机相针式滤器过滤。衍生化试剂:精密称取OPA120mg，溶解于3mL甲醇中，加入15mL0.1mol•L－1的四硼酸二钠溶液，加入150μL2－巯基乙醇，混匀，试剂室温、暗处过夜处理，使用前过滤。阿米卡星标准储备液:精密称取阿米卡星标准品1mg，加入1mL的水溶解混匀、过滤，配制为1mg•mL－1的阿米卡星标准储备液。磷酸二氢钠流动相的配制:精密称取磷酸二氢钠7.80g，溶于800mL水中，用硼酸调pH至3.67后定容至1000mL的容量瓶中。使用前用真空抽滤机将溶液过滤，超声脱气备用。

1.2色谱条件色谱柱:inertsilODS－3V(5μm，4.6×150mm);保护柱;流动相:甲醇:0.05mol•L－1磷酸二氢钠(pH=3.67)(体积70∶30);荧光检测波长:激发波长342nm，发射波长440nm;流速1.0mL•min－1;柱温:40℃。

1.3衍生反应阿米卡星在0.5～50μg•mL－1的浓度范围内，通过测定不同OPA衍生剂的量、衍生时间对阿米卡星的影响，确定阿米卡星衍生的最佳条件。取阿米卡星标准储备液稀释后的溶液200μL于进样瓶中，加入OPA衍生剂200μL，具塞震荡混匀1min后取20μL进样。

1.4标准曲线的绘制取阿米卡星标准储备液依次稀释为0.5、1、2、5、8及20μg•mL－1这一系列浓度的溶液，取各个浓度的溶液200μL，按1.4的条件衍生后，取20μL进样检测，并且重复3次取平均值。以阿米卡星的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并作回归分析，得出回归方程和相关系数。

1.5检测限与定量限检测限是反映分析方法整体的灵敏度的指标，是从样品背景信号中检测出待测物质存在时所需的最低浓度;定量限是样品中待测物质能够被定量测定的最低量，结果具有准确度和精确性。配制不同浓度阿米卡星标准品溶液，添加到空白血浆中，按血浆样品净化的方法提取净化，HPLC分析。以信噪比3∶1作为检测限，以信噪比10∶1作为定量限。

1.6精密度与回收率精密量取适量空白血浆样品，按照阿米卡星标准曲线的制备方法，分别配制含阿米卡星低、中、高(1、5及10μg•mL－1)三个浓度的血浆样品，每个浓度按血浆样品预处理方法处理后，重复进样5次，取平均值计算提取回收率、相对标准偏差(RSD)和日内变异系数，同时每份样品1周内连续测定5d，计算日间变异系数。

1.7血液样品的净化取保存于－20℃冰箱内的血浆样品，溶解回温后精密量取血浆样品200μL于离心管内，加入pH10.38的四硼酸二钠缓冲液200μL，漩涡混合后，加入乙腈400μL，漩涡震荡1min，1200r•min－1离心10min，取上清液200μL待用。

1.8给药和采样选择健康成年混血犬8只，体重约为10kg，并在试验前，所有犬只至少饲养7d，且在试验前没有使用过任何会影响阿米卡星代谢的药物，整个试验期间，严密观察各犬的精神状态和临床反应，包括食欲、饮欲、大小便情况以及可能出现的胃肠道等方面的不良反应。试验时，称重后，皮下注射硫酸阿米卡星，给药剂量为10mg•kg－1，于给药前0.5h，给药后5、10、15及30min和1、2、4、8、12、24、48、72及96h颈静脉采血，所有样品采血后离心，取血浆，进行药代动力学测定。

1.9血－药浓度数据的处理根据血浆药物浓度－时间数据，做药时曲线图，药时曲线和标准曲线图均采用Excel软件绘制。运用SPSS18.0软件中进行统计分析和中国药理学会编制的3P97软件计算药代动力学参数，并给出最可能的房室模型，统计值以平均数±标准差(Mean±SD)表示。

2结果

2.1阿米卡星的色谱按照1.3的色谱条件，所得空白血浆、阿米卡星血浆样品、阿米卡星血浆样品加标色谱见图1－图3。结果表明:高效液相色谱法基线走势平稳，阿米卡星出峰时间大约为10.046min，其中血液样品经过净化后，杂峰较少，杂峰目标峰分离较好，血浆中内源性物质不会干扰主峰阿米卡星的分离。

2.2标准曲线以峰面积为纵坐标，以待测样品的浓度为横坐标，以加权最小二乘法进行回归运算，所得阿米卡星溶液浓度在0.5～100μg•mL－1之间，线性关系良好，回归方程为y=10008x+24570，相关系数R2=0.997，阿米卡星的定量限0.5μg•mL－1，最低检测浓度达到0.2μg•mL－1。标准曲线见图4。2.3阿米卡星精密度和提取回收率的测定当血浆样品中添加的阿米卡星的浓度分别为1、5及10μg•mL－1时，其提取回收率(n

=5)分别为(91.41±8.78)%、(93.56±6.16)%及(95.58±4.81)%。结果表明:本试验条件下所用方法的精密度符合要求，测定方法可靠。当血浆样品中添加的阿米卡星的浓度分别为1、5及10μg•mL－1时，其日内变系数(n=5)分别为6.68%、5.54%及5.24%，日间变异系数(n=5)分别为7.36%、5.94%及5.64%。结果表明:本试验条件下所用方法的精密度符合要求，测定方法可靠。

2.4阿米卡星在犬体内的药代动力学特征各组犬按10mg•kg－1单剂量皮下注射阿米卡星后，将不同的时间点所得血浆样品经过处理后进行分析，所得血药浓度变化见下表。根据血浆药物浓度时间数据，采用Excel软件绘制药－时曲线，见图6。由结果可知，血浆中阿米卡星浓度的达峰时间为给药后0.5～1h，阿米卡星的血药浓度在给药后2h后开始下降。

2.5犬单剂量皮下注射阿米卡星后的主要药代动力学参数采用中国药理学会编3P97软件将上述实测所得的药时浓度数据进行处理，行拟合优度值(odness－of－fitvalue)比较，利用AIC最小值原则结合F检验法得出最佳房室模型。通过比较发现，犬单剂量皮下组织阿米卡星在犬体内的代谢过程符合一级吸收二室开放的药代动力学模型，其中权重系数为1/C。同时运用梯形面积法计算并得到A、Tmax、AUC、Cmax等主要药动学参数，具体见表1。在本试验的条件下，犬在10mg•kg－1单剂量皮下注射阿米卡星之后的药物浓度达峰时间(Tmax)为(0.886±0.06)h，峰浓度(Cmax)为(31.35±1.41)μg•mL－1，血浆中阿米卡星的T1/2β(消除半衰期)为(1.779±0.13)h，这表明阿米卡星为短效消除药物;阿米卡星的药时曲线下面积(AUC)为(104.9±8.46)μg•h•mL－1，这表明阿米卡星在犬体内分布广泛，代谢、消除时间短。本试验所选用的测定血浆内的阿米卡星浓度的高校液相分析方法能满足对阿米卡星的临床效果的评价要求，具有准确、灵敏、重现性好的优点。

3讨论

阿米卡星是卡那霉素A在C－1的氨基上引入α－羟基－γ－氨基丁酸得到的，其具有极性强、水溶性大和无挥发性等特点，且缺少紫外吸收基团，因此采用紫外检测具有一定的难度。但阿米卡星在结构上具有活泼基团(氨基)，因此可以利用这个特征，使阿米卡星与衍生化试剂进行反应而成在紫外区间有吸收或有荧光的物质，即可利用紫外或荧光进行检测。阿米卡星在有2－巯基乙醇存在、pH为9～11的条件下，伯胺基化合物可作为亲核试剂与OPA发生反应生成1－硫代－2－烷基异吲哚，试剂过量2～3个数量级的情况下可在数秒内完成，且过量的衍生化试剂不影响HPLC的测定结果。由于OPA衍生化试剂信号很快衰减，故本试验采用柱前衍生法进行衍生。去除血浆中蛋白的方法有无水乙醇沉淀法、磺基水杨酸沉淀法、乙腈沉淀法和三氯乙酸沉淀法等。由于OPA衍生时的最佳pH值为10.4，而水杨酸和磺基乙酸沉淀法会改变血液样品的pH值从而会影响衍生程度，因此参考相关文献，在血液样本的处理上采用乙腈沉淀蛋白时血浆与乙腈的体积比为1∶2时即能除去95%的蛋白质，故在试验中采用了乙腈沉淀法。

在衍生反应条件的优化上主要考察了浓度一定的情况下，OPA的体积对反应程度的影响，结果表明OPA衍生剂与阿米卡星进行衍生反应的最适浓度为1∶1(V/V)。皮下注射硫酸阿米卡星后，尽管跟相关参考文献的给药剂量相同，但T1/2α和T1/2β均大于文献报道的小猎犬(分别为0.472h和1.193h)和灰狗(分别为0.476h和1.220h)的，V/F比小猎犬(0.229L•kg－1)和灰狗(0.241h)的小，这表明犬皮下注射硫酸阿米卡星后吸收完全且较迅速，消除较缓慢。本试验中Tmax和Cmax均比小猎犬(分别为0.671h和25.86μg•mL－1)和灰狗(分别为0.640h和27.40μg•mL－1)的大，说明硫酸阿米卡星在混血犬体内经皮下注射后其达峰时间比小猎犬和灰狗长，但峰浓度高。硫酸阿米卡星在动物体内的代谢与动物品种有关，即药代动力学特征差异大。也有文献显示同样品种不同给药途径，硫酸阿米卡星在动物体内的药代动力学参数也会出现明显差异。因此在兽医临床用药中应根据不同动物、不同品种的具体药代动力学特征、甚至对具体的给药方式也需要进行评估来制定给药方案，从而避免产生毒副作用。

作者：唐龙琴周闯孙一涵张海彬单位：南京农业大学动物医学院