溴氰菊酯对仔体内酶活性的探讨范文

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《生态毒理学报》2016年第一期

摘要:

采用不同质量浓度的溴氰菊酯(0.0070mg•L-1、0.014mg•L-1、0.020mg•L-1、0.027mg•L-1)对菲律宾蛤仔进行20d半静置染毒，测定不同时间淋巴液中乙酰胆碱酯酶(AChE)和钠离子-钾离子-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATPase)活性、鳃和肝脏中谷胱甘肽转硫酶(GST)活性的变化，并观察染毒20d后鳃丝组织和消化盲囊组织的损伤情况。酶活性分析结果显示，与对照组相比，低浓度组(0.0070mg•L-1)试验期间酶活性均无显著差异(P>0.05);中浓度组(0.014mg•L-1、0.020mg•L-1)淋巴液中AChE和Na+-K+-ATPase均呈先激活后抑制的变化规律(P<0.05)，鳃和肝脏中GST活性均呈上升趋势(P<0.05);高浓度组(0.027mg•L-1)淋巴液中AChE和Na+-K+-ATPase、肝脏中GST活性在试验期间持续下降(P<0.01)，而鳃中GST活性呈先抑制后升高的趋势(P<0.05)。研究表明，低中浓度的溴氰菊酯对菲律宾蛤仔体内的酶活性表现为先诱导后抑制，具有明显的时间、剂量效应;高浓度的溴氰菊酯对菲律宾蛤仔体内酶活持续抑制，且染毒浓度越高，组织细胞变异越显著，表现为鳃丝上皮细胞纤毛层萎缩、纤毛脱落，消化盲囊上皮细胞膨胀，出现包涵体样结构。

关键词:

溴氰菊酯;菲律宾蛤仔;酶活性;组织损伤

溴氰菊酯(deltamethrin)又名敌杀死，化学式为C22H19Br2NO3，是Ellion于1974年在研究天然除虫菊酯化学结构的基础上合成的一种含有α-氰基的Ⅱ型拟除虫菊酯类仿生杀虫剂[1]。溴氰菊酯性质稳定，杀虫谱广，杀虫活性高，属神经性毒剂，其对高等动物的毒性中等，但对鱼类等水生生物为高毒[2]。目前的大多数研究主要集中在其对鱼、虾类的急性和亚急性毒性试验[3-5]，而对在水环境中占有重要地位的贝类的毒性及作用机制研究很少。

菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)广泛分布于中国南部沿海，是中国主要的经济贝类之一。由于其生长迅速、生殖周期短、容易饲养、基础研究较为深入等特点，是理想的模式动物，经常被用于环境毒理学的相关研究[6]。研究表明，重金属[7]、酚类污染物[8]、十溴联苯醚[6]等对菲律宾蛤仔体内的抗氧化酶活性的影响均表现出一定的规律性。而至今，溴氰菊酯对菲律宾蛤仔的毒性研究主要在急性毒性效应方面[9]，致毒机制的研究尚未见报道。本项目通过研究不同时间、不同浓度溴氰菊酯对菲律宾蛤仔淋巴液中乙酰胆碱酯酶(AChE)和钠离子-钾离子-三磷酸腺苷酶(Na+-K+-ATPase)活性、鳃和肝脏中谷胱甘肽转硫酶(GST)活性的变化，观察染毒后溴氰菊酯对鳃丝组织和消化盲囊组织的影响，探讨相互间的浓度-效应关系，寻找敏感指标，以期从免疫酶学及组织病理学角度探讨溴氰菊酯对菲律宾蛤仔的毒性作用机制。

1材料与方法(Materialsandmethods)

1．1试验材料菲律宾蛤仔:壳长为(3.87±0.24)cm，体重为(11.4±1.75)g，购于东山湾菲律宾蛤仔养殖区，当天阴凉干运至福建省海水鱼类科研繁育中试基地。溴氰菊酯原药:浓度为25g•L-1，山东邹平农药有限公司生产，用蒸馏水溶解稀释成50.0g•L-1母液备用;其余试剂均为国产分析纯。

1．2试验方法采用GB/T16310.1—1996《船舶散装运输液体化学品危害性评价规范水生生物急性毒性试验方法》，求出溴氰菊酯对菲律宾蛤仔的96h半致死质量浓度(96h-LC50)为0.057mg•L-1。菲律宾蛤仔在3.7m×2.0m×0.5m水泥池中适应5d后开始正式试验，选取96h-LC50的1/2以下5个浓度梯度(0、0.0070mg•L-1、0.014mg•L-1、0.020mg•L-1、0.027mg•L-1)对菲律宾蛤仔进行半静置染毒，每个池子投放密度50~60个•m-2，各组均设2个平行。试验过程不投饵，每24h更换1次试验液，暴露20d。分别在用药后的5d、10d、15d、20d采样，做好记录后立即置于-40℃保存备用，以进行菲律宾蛤仔体内组织中AChE、Na+-K+-ATPase和GST活性分析和细胞组织切片观察。试验期间保证养殖水温(20.5±0.65)℃，溶氧(6.27±0.10)mg•L-1，pH值为(7.69±0.04)，盐度(29.1±0.2)。

1．3样品处理及酶活性的测定方法取菲律宾蛤仔体液、鳃、肝样品，其中鳃、肝样品分别在冰水浴中研磨后加入9倍体积预冷的PBS缓冲液(pH7.2)，4℃离心取上清液稀释10倍后用于酶活性分析。AChE、Na+-K+-ATPase以及GST活性测定参照试剂盒(购自南京建成生物研究所)说明书进行。

1．4光镜样品的制备与观察［10］取菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊组织，大小在0.5cm3以内，用Bouin’s液固定，常规梯度乙醇(体积分数为70%、80%、85%、95%、100%)脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，德国LeicarRM2145切片机连续切片，厚度为5μm，经苏木素－伊红染色，脱水封片后，在LeicaDMR荧光倒置显微镜下观察并拍照记录样品。1．5数据处理试验数据用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)，对均值进行差异显著性检验。

2结果与分析(Resultsandanalysis)

2．1溴氰菊酯对菲律宾蛤仔淋巴液中AChE和Na+-K+-ATPase活性的影响图1显示，整个试验期间除低浓度组和高浓度组外，其余2组AChE活性均呈现先激活后抑制的现象。其中0.0070mg•L-1组由于浓度较低，整个试验期间AChE活性均无显著性变化(P>0.05);0.014mg•L-1组在暴露第5～15天时AChE活性均显著高于对照组(P<0.05)，在暴露第15天时AChE活性达到最高值，比对照组上升了45.4%，在暴露第20天时，AChE活性下降到正常水平;0.020mg•L-1组在暴露第5天时AChE活性最高，比对照组上升了16.5%，之后持续下降;0.027mg•L-1组在整个试验期间AChE活性持续下降，均显著低于对照组(P<0.05)。在暴露第20天，4组AChE活性受到的抑制率分别为2.3%(P>0.05)、7.0%(P>0.05)、20.9%(P<0.05)、27.9%(P<0.01)。图2显示，整个试验期间除低浓度组和高浓度组外，其余2组Na+-K+-ATPase活性均呈现先激活后抑制的现象，并且较高浓度组活性升高幅度最大，下降速度也快于较低浓度组。0.0070mg•L-1组由于浓度较低，整个试验期间Na+-K+-ATPase活性均无显著性变化;0.014mg•L-1、0.020mg•L-1组在暴露第5天和第10天时Na+-K+-ATPase活性均显著高于对照组(P<0.05)，在暴露第10天时Na+-K+-AT-Pase活性最高，分别比对照组上升了16.3%、16.7%，之后2组Na+-K+-ATPase活性均受到不同程度的抑制;0.027mg•L-1组在试验期间Na+-K+-AT-Pase活性持续下降，显著低于对照组(P<0.05)。在暴露第20天，4组Na+-K+-ATPase活性受到的抑制率分别为15.0%(P>0.05)、18.9%(P<0.05)、28.5%(P<0.01)、34.5%(P<0.01)。

2．2溴氰菊酯对菲律宾蛤仔鳃和肝脏中GST活性的影响图3所示的为溴氰菊酯对菲律宾蛤仔鳃中GST活性的影响。0.0070mg•L-1组由于浓度较低，整个试验期间鳃GST活性均无显著性变化;0.014mg•L-1组和0.020mg•L-1组试验期间鳃GST活性总体均呈上升趋势，0.014mg•L-1组GST活性上升速度最快，在暴露第20天2组GST活性分别比对照组上升了33.2%(P<0.01)、20.2%(P<0.05);0.027mg•L-1组在试验期间鳃GST活性呈先抑制后缓慢上升趋势，在暴露第5天时活性最低，抑制率为21.8%(P<0.05)，暴露第15～20天时，与对照组无显著差异。图4所示的为溴氰菊酯对菲律宾蛤仔肝脏中GST活性的影响。除0.027mg•L-1组外，随着暴露时间的延长，肝脏GST活性均有先升高后缓慢降低的趋势。0.0070mg•L-1组在暴露第15天时肝脏GST活性比对照组上升了9.60%，显著高于对照组(P<0.05);0.014mg•L-1和0.020mg•L-1组在整个试验期间均显著高于对照组(P<0.05)，其中0.014mg•L-1组在暴露第15天时最高，比对照组上升29.8%(P<0.01)，0.020mg•L-1组暴露第10天时最高，比对照组上升25.6%(P<0.01);0.027mg•L-1组GST活性在试验期间持续下降，在暴露第20天时抑制率为18.4%(P<0.01)。而其他3组在暴露第20天时，肝脏GST活性分别比对照组升高了10.4%(P>0.05)、28.4%(P<0.01)、19.9%(P<0.01)。

2．3菲律宾蛤仔鳃丝组织切片结果本试验观察了0mg•L-1、0.0070mg•L-1、0.014mg•L-1、0.027mg•L-1这4个剂量组的染毒20d后鳃丝组织切片样本。图5a显示，对照组菲律宾蛤仔鳃上皮细胞规则，上皮细胞形态正常，可见完整的纤毛层;染毒浓度0.0070mg•L-1组鳃丝上皮细胞较规则，可见较完整的纤毛层(图5b);染毒浓度0.014mg•L-1组和0.027mg•L-1组鳃丝上皮细胞纤毛层萎缩、纤毛脱落，0.027mg•L-1组变异程度高于0.014mg•L-1组(图5c、图5d)。说明同样的时间效应下，溴氰菊酯的浓度和菲律宾蛤仔的鳃丝组织细胞损伤程度成正相关。

2．4菲律宾蛤仔消化盲囊组织切片结果本试验观察了0、0.0070mg•L-1、0.014mg•L-1、0.027mg•L-14个剂量组的染毒20d后消化盲囊组织切片样本。对照组菲律宾蛤仔消化盲囊上皮细胞形态正常(图6a);染毒浓度0.0070mg•L-1组上皮细胞膨胀，没有出现细胞变异(图6b);随着染毒浓度的增加，上皮细胞膨胀逐渐严重，细胞发生变异，0.014mg•L-1组和0.027mg•L-1组均出现包涵体样结构(图6c、图6d)，这可能是生物应对外界不良环境的一种应激体现。说明同样的时间效应下，溴氰菊酯的浓度和菲律宾蛤仔的消化盲囊组织细胞损伤成正相关。

3讨论(Discussion)

目前对拟除虫菊酯的神经毒性作用机制的研究普遍认为乙酰胆碱酯酶(AChE)和腺苷三磷酸酶(AT-Pase)为此类化合物作用的靶标酶[11-12]。AChE是生物神经传导中的一种关键酶，在神经传导中执行着重要的功能。该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对于突触后膜兴奋刺激作用，保证神经信号分子在生物体内正常的传导[13]。AChE作为生物体的一种生化指标，已被广泛应用于农药毒性和环境污染评价[14]。Na+-K+-ATPase是存在于细胞质膜上水解ATP获得能量、逆电化学梯度转运Na+，同时反方向转运K+的一种内膜蛋白，也称钠泵，其广泛存在于各类细胞质膜上，是多种毒物作用的靶位点，对毒物十分敏感[15]。由于国内外溴氰菊酯对贝类的相关文献较少，比较其他类似的报道有，Naomi等[16]研究暴露于0.5～1.0mg•L-1毒死蜱后亚洲蛤(Cor-biculafluminea)体内AchE活性有显著的下降，96h后，抑制率分别为84%(0.5mg•L-1)和87%(1.0mg•L-1)。Mchenery等[17]报道敌敌畏对紫贻贝(MytilusedulisL.)鳃中AchE活性呈现低浓度增加，高浓度降低的情况。谭晓珍等[18]研究发现，暴露与氯氰菊酯和氰戊菊酯后栉孔扇贝(Chlamysfarreri)鳃中Na+-K+-ATPase活性随农药浓度的增加而升高。本试验结果表明:溴氰菊酯的低浓度组对菲律宾蛤仔淋巴液中AChE和Na+-K+-ATPase活性均无显著性改变，中浓度组则均呈先激活后抑制的变化规律，而高浓度组试验期间AChE和Na+-K+-ATPase活性均持续受到抑制。同时，在试验初期呈现出一定的浓度-剂量效应，随着溴氰菊酯浓度的增加和染毒时间的延长，对AChE和Na+-K+-ATPase的抑制均增强。笔者认为，出现这种现象可能是生物体抵抗外界不良环境的一种应激反应，此时机体将调动各方面的能力包括淋巴液中酶的超常活动，以抵抗外来危害。而随着试验时间的延长和溴氰菊酯的累积，超出机体的调节能力，导致机体正常功能受到了严重干扰，最终表现为抑制作用。

谷胱甘肽转硫酶(GST)属于Ⅱ相酶类，可以催化从Ⅰ相代谢产生的亲电子性的物质，形成疏水性化合物，容易随胆汁排出体外，起到解毒的功能[19]。GST不但是解毒系统第二阶段的解毒酶，而且还是重要抗氧化系统酶，其活性的高低间接反映了机体清除自由基的能力，同时GST可作为水环境中农药污染物的生化标记[20-21]。任加云和李树峰[22]的研究表明栉孔扇贝在低质量浓度(0.5μg•L-1、1.0μg•L-1)多氯联苯处理下，消化盲囊和鳃丝的GST活力均呈上升的趋势，而在高质量浓度(10μg•L-1、50μg•L-1)下，GST活力均呈先上升后下降的趋势。陈颖[23]研究四溴双酚A(TBBPA)对翡翠贻贝(Pernaviridis)肝胰腺GST活性的影响表明，低浓度(或暴露初期)可诱导GST活性，而250μg•L-1(或暴露后期)表现为抑制作用。张先勇等[24]研究苯并[a]芘对马氏珠母贝(Pinctadamartensi)肝组织的毒性作用时发现，在暴露3d时，GST活性被激活，在7d和10d受到抑制。本试验中溴氰菊酯对菲律宾蛤仔鳃和肝脏中GST活性的影响结果表明:低、中浓度组的菲律宾蛤仔随着暴露时间的延长，其鳃和肝中GST活性总体呈上升趋势，且肝中GST活性上升速度较快;高浓度组鳃和肝中GST活性均受到抑制。原因可能是与鳃长期和外界直接接触，对外界环境刺激反应弱化，而肝脏是菲律宾蛤仔重要的解毒器官有关。

同时随着染毒时间的延长，溴氰菊酯对肝脏GST活性的抑制作用加强，这可能是由于随着时间的延长，肝脏等组织细胞受损程度加重，甚至坏死，致使GST合成逐渐减少。鳃是双壳贝类的呼吸滤食器官，直接与水环境接触，具有气体交换和调节离子平衡的重要作用。鳃的损坏往往破坏其呼吸作用，打破体内离子平衡，甚至导致生物体的死亡[25]。消化盲囊是贝类消化和解毒代谢的主要器官，其中消化细胞负责营养物质消化、吸收及储存能量。关于拟除虫菊酯杀虫剂对鱼类的组织病理学研究较多[26-27]，对贝类研究未见报道。本研究结果表明，随着染毒浓度的升高，细胞损伤变异显著。鳃丝上皮细胞表现为纤毛层萎缩、纤毛脱落;消化盲囊上皮细胞膨胀，出现包涵体样结构。总体上，溴氰菊酯浓度和菲律宾蛤仔的组织细胞损伤程度呈正相关，说明在亚急性实验中，溴氰菊酯对通过损伤菲律宾蛤仔的鳃组织和消化盲囊细胞来影响着菲律宾蛤仔的新陈代谢，包括细胞免疫酶的反应，进而导致菲律宾蛤仔的死亡，且该影响是缓慢的，渐进的。本研究结果对于菲律宾蛤仔生产中溴氰菊酯的安全使用和水产品质量安全有着一定的指导和参考意义。

作者：许贻斌 郑惠东 陈宇锋 郑盛华 陈小红 钟硕良 单位：福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室