双酶提取蒲公英根多糖工艺优化范文

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摘要：以蒲公英根烘焙粉为原材料，研究了酶添加量、酶解温度和酶解时间在单酶和双酶协同酶解条件下对多糖得率和DPPH自由基清除率的影响，并采用响应曲面法（RSM）优化了酶解工艺参数，结果表明双酶法提取多糖优于单酶法，适宜的多糖提取条件为：料水比1：30（g/mL），木瓜蛋白酶悬液添加量为1.98mL（浓度200U/mL），纤维素酶悬液添加量为0.99mL（浓度200U/mL），55°C提取1.90h，此时多糖得率为32.97±0.13%，DPPH自由基清除率为92.31±0.25%，酶解与抗氧化活性具有一定的协同作用。

关键词：蒲公英根；多糖；协同酶解；响应面法；抗氧化性

蒲公英（TaraxacummongolicumHand.–Mazz），菊科，为多年生草本植物，种类繁多，营养价值和药用价值高，资源丰富[1]，2014年被国家卫生计生委列入药食同源目录。蒲公英中根部多糖含量最高[2]。研究显示，蒲公英多糖具有降血糖[3]、抗癌[4]、治疗补体系统过度活化引起的疾病[5]、治疗溃疡性结肠炎[6]、调节肠道微生态[7]等作用。目前多糖提取常用的方法有：热水浸提法、超声辅助提取法、酶提取法等[8]。热处理会造成多糖降解[9]，而酶解法不仅能提高多糖得率还有助于保持多糖的活性，因而受到广泛关注。徐澜[10]等采用木瓜蛋白酶对蒲公英进行酶解，多糖得率为3.08%，优于传统的热水提取；Wang[11]等使用纤维素酶提取蒲公英多糖，得率达20.67％。但以上报道均为单酶法提取蒲公英多糖，有研究显示，复合酶提取法能够有效提高多糖提取率[12-13]。但应用在蒲公英根多糖的提取尚未见报道。本文以烘焙后的蒲公英根粉为原料，采用木瓜蛋白酶-纤维素酶双酶协同提取蒲公英根多糖，并通过响应面试验对蒲公英根粉酶解工艺参数进行优化。以期为蒲公英根多糖提取提供新的思路和借鉴，促进蒲公英产业发展。

1材料与方法

1.1材料与试剂

蒲公英根粉：80目，试验室自制；纤维素酶：400U/mg，北京奥博星生物技术有限责任公司；木瓜蛋白酶：50万U/g，上海源叶生物科技有限公司；重蒸酚：北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、浓硫酸均为分析纯。

1.2仪器与设备

AR423CN型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；H.SWX-600BS型电热恒温水温箱，金坛市朗博仪器制造有限公司；C20—SH2040型美的多功能电磁炉，美的集团股份有限公司（广东）；PAL-α型手持糖度计，ATAGO（爱拓）中国分公司；UV2200型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1酶解工艺实验设计1）酶解工艺流程。蒲公英根粉→加水→加酶悬液→水浴酶解→沸水浴灭酶5min→快速冷却→300目滤布过滤2）工艺要点。蒲公英根粉：蒲公英根粉碎过80目检验筛，120℃烘焙35min，每10min翻动一次，防止焦糊。酶悬液的配制：木瓜蛋白酶悬液200U/mL，纤维素酶悬液200U/mL，4℃保存待用。

1.3.2单因素实验1、料水比与酶解效果实验准确称取1.00g蒲公英根粉2份于三角瓶中，分别加入纤维素酶、木瓜蛋白酶悬液各1.0mL，料水比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g/mL。混合液混匀后置于水浴锅中60℃酶解1.5h，沸水浴灭酶5min，快速冷却至室温。过滤后测定酶解液多糖含量、可溶性固形物含量、DPPH自由基清除率，实验重复3次。2、酶解温度对酶解效果实验准确称取1.00g蒲公英根粉2份于三角瓶中，料水比为1:30g/mL，酶解温度设置为：30、40、50、60、70℃，按1.3.2中1的实验操作，确定适宜酶解温度，实验重复3次。3、酶添加量对酶解效果实验准确称取1.00g蒲公英根粉2份于三角瓶中，料水比为1:30g/mL，分别加入木瓜蛋白酶悬液：0、0.5、1、2、3、4mL、纤维素酶悬液：0、0.5、1、2、3、4mL，置于水浴锅中木瓜蛋白酶处理组50℃、纤维素酶处理组60℃酶解，按1.3.2中1的实验操作，确定木瓜蛋白酶、纤维素酶的适宜添加量。实验重复3次。4、双酶协同对酶解效果实验（1）双酶添加量对酶解效果实验准确称取1.00g蒲公英根粉于烧杯中，料水比为1:30g/mL，加入纤维素酶悬液1mL，木瓜蛋白酶悬液添加量为：0、1、2、3、4mL，酶解温度50℃，按1.3.2中1的实验操作，确定适宜的双酶添加量。实验重复3次。（2）酶解温度对双酶酶解效果实验准确称取1.00g蒲公英根粉于烧杯中，料水比为1:30g/mL，加入纤维素酶悬液1mL、木瓜蛋白酶悬液2mL，酶解温度设置为50、55、60℃，按1.3.2中1的实验操作，确定适宜的酶解温度。实验重复3次。（3）酶解时间对双酶酶解效果实验准确称取1.00g蒲公英根粉于烧杯中，料水比为1:30g/mL，加入纤维素酶悬液1mL、木瓜蛋白酶悬液2mL，酶解温度55℃，酶解时间分别设置为：0.5、1、1.5、2、2.5、3h，按1.3.2中1的实验操作，确定适宜的酶解时间。实验重复3次。

1.3.3响应面试验设计在单因素试验基础上，确定双酶协同酶解效果更佳。以酶添加量、酶解温度、酶解时间为变化值，采用DesignExpert8.05软件进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，以多糖含量为响应值，通过回归分析各工艺参数与响应值之间的关系，对提取条件进行优化。

1.4理化指标测定

1.4.1可溶性固形物含量测定使用手持糖度计测量溶液的可溶性固形物含量，试验重复三次。

1.4.2多糖含量测定采用硫酸—苯酚法测定多糖含量[10]葡萄糖标准曲线的绘制：以光密度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。按式（1）计算多糖得率。

1.4.3DPPH自由基清除率的测定[14]将酶解液适当稀释后测定，各处理常温避光反应30min，525nm下测定吸光度，按式（2）计算清除率。

2结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线分析以葡萄糖标准品质量数为横坐标x，OD490值为纵坐标y，对散点图通过线性回归绘制标准曲线，计算出回归方程为：y=0.54583x+0.04172，R2=0.9940，表明该曲线线性良好，可用于计算多糖含量。

2.2单因素实验结果分析

2.2.1料水比对酶解效果的影响以纤维素酶、木瓜蛋白酶悬液添加量各1.0mL，60℃酶解1.5h，考察1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g/mL的料水比对蒲公英根酶解效果的影响。

2.2.2酶解温度对酶解效果的影响以料水比为1：30g/mL，纤维素酶、木瓜蛋白酶悬液添加量各1.0mL，酶解1.5h，考察30、40、50、60、70℃酶解温度对蒲公英根酶解效果的影响。

2.2.3酶添加量对酶解效果的影响以料水比为1：30g/mL，木瓜蛋白酶处理组50℃、纤维素酶处理组60℃酶解1.5h，考察0、0.5、1、2、3、4mL木瓜蛋白酶悬液添加量和0、0.5、1、2、3、4mL纤维素酶悬液添加量对蒲公英根酶解效果的影响。

2.2.4双酶协同作用对酶解效果的影响（1）双酶添加量对酶解效果的影响以料水比为1：30g/mL，50℃酶解1.5h，纤维素酶悬液添加量为1mL，木瓜蛋白酶悬液分别添加0、1、2、3、4、5mL考察双酶添加量对蒲公英根酶解效果的影响。（2）双酶酶解温度对酶解效果的影响以料水比为1：30g/mL，纤维素酶悬液添加量为1mL、木瓜蛋白酶悬液添加量为2mL，酶解时间为1.5h，考察50、55、60℃酶解温度对蒲公英根双酶酶解效果的影响。（3）双酶酶解时间对酶解效果的影响以料水比为1：30g/mL，纤维素酶悬液添加量为1mL、木瓜蛋白酶悬液添加量为2mL，酶解温度为55℃，考察0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h酶解时间对蒲公英根双酶酶解效果的影响。

2.3响应面试验结果与分析

蒲公英根粉酶解工艺参数响应面试验结果如表2。通过响应面设计软件Design-Expert，对表2结果的处理并经回归整合，得到自变量与蒲公英根多糖得率（Y1)的二次多项回归方程。

3结论

1）双酶协同酶解效果优于单酶，通过响应面法建立了酶解提取蒲公英根多糖的工艺数学模型Y1的二次多项回归方程：Y1=32.9-0.59A-0.60B-0.54C+0.34AB-0.93AC-0.47BC-6.7A2-1.73B2-1.67C2回归分析表明该模型稳定性较好，能很好地描述蒲公英根粉酶解过程中多糖得率随酶解条件的变化规律，可以用此模型对多糖的得率进行分析和预测。影响多糖得率的因素按照由大到小顺序排列为：酶解时间（B）、酶解温度（A）、酶添加量（C）；2）通过软件（Design-ExpertV8.0）分析得到优化的多糖得率酶解条件为：酶解温度为55℃，酶解时间为1.90h，纤维素酶添加量0.99mL，木瓜蛋白酶悬液添加量为1.98mL，料水比1∶30。经验证，蒲公英根多糖得率为32.97mg/g，响应面结果可靠。3）蒲公英根原材料、蒲公英根烘焙粉、蒲公英根酶解液的多糖得率分别为10.18±0.18%、18.74±0.58%、32.97±0.13%，表明通过烘焙和酶解工艺可以提高蒲公英根多糖得率；其DPPH自由基清除率分别为28.73±1.01%、55.69±0.41%、92.31±0.25%，表明蒲公英根多糖对DPPH自由基有一定的清除能力，且与多糖浓度呈正相关。

作者：刘珊珊；刘亚琼；张琦 单位：河北农业大学