木霉菌分生孢子水分散粒剂的研制范文

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《农药杂志》2015年第七期

近年来随着各国政府和民众对环境保护和食品安全的日益关注，化学农药已受到了极大的限制。微生物农药因其无公害、无污染、无残留且有害生物对其不易产生抗药性等特点，已在研发和应用上获得了长足的发展。在我国，以B.t.杀虫蛋白、井冈霉素和阿维菌素为主的各类微生物农药施用面积已占病虫害防治总面积的15%以上。云南农业大学和中国农业大学共同研制的枯草芽孢杆菌B908“白抗”可湿性粉剂能够有效的防治番茄灰霉病、西瓜枯萎病，具有商业化潜力。华东理工大学和上海泽元海洋生物技术有限公司合作，成功的开发出了多粘类芽孢杆菌0.1亿cfu/g颗粒剂，同时还在进行10亿cfu/g可湿性粉剂的放大生产可行性研究。这些商品的应用，不仅缓解了当今由化学农药所造成的环境污染问题，同时也帮助农民得到了更多的实惠，使微生物农药成为当今农药发展的热点。国内、外科研人员对木霉菌生物制剂在作物病害防治上的应用已做了大量的工作，但产品的种类仅限于粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂。国际上已经商品化的活菌水分散颗粒剂多见于细菌产品，美国开发的B.t.鲇泽亚种水分散性颗粒剂，具有贮运方便、稳定性高、污染少等优点。然而，有关木霉菌水分散颗粒剂开发的报道还不多见，特别是木霉菌孢子在产品加工过程中对脱水的耐性，以及产品制作过程中的工艺条件对成品货架期的影响等方面，仍需进行更深入的研究。本实验通过对不同的填料和助剂的筛选，以及对加工过程中的温度和成品的含水量对木霉菌分生孢子货架期影响等方面的测定，为开发高质量的木霉菌水分散粒剂，提供了可参考的依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1Tr309T分生孢子原粉的生产本实验所用的木霉菌株Tr309T是上海万力华生物科技有限公司从采集的土壤样品中分离得到的，经鉴定为绿色木霉菌(Trichodermaviride)。将Tr309T接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上培养96h，用无菌接种针刮平板上的分生孢子并将孢子转移到含有500mL葡萄糖马铃薯培养液(PDB)的三角瓶中。再通过血球计数板和无菌蒸馏水，将孢子液的含量定容到1×107个孢子/mL，放置在28℃、200r/min的摇床上培养168h，再通过离心(2500r/min，离心15min)，在35℃温度条件下，自然干燥15h，得到Tr309T孢子原粉，其孢子含量为2×109个/g，含水量7%，细度过44μm的标准筛，外观为深绿色粉末。

1.1.2填料与助剂填料：硅藻土A(20μm)，硅藻土B(15μm，白色)，膨润土(20μm，灰白色)，石家庄长利矿石有限公司；滑石粉(20μm，白色，创宇化工有限公司)；高岭土(20μm，白色，灵寿兰祥矿石产品有限公司)。助剂：葡萄糖、麦芽糊精、聚乙烯醇、甲基纤维素、十二烷基硫酸钠(SDS)、木质素磺酸钠、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐(NNO)、氯化钠、硫酸铵、尿素，均为化学纯，上海润捷化学试剂有限公司；拉开粉(BX)，工业级，上虞浙创化工有限公司。

1.1.3主要仪器与设备闪蒸干燥(常州豪顺干燥设备有限公司XG-00)，恒温干燥箱(上海一恒科技有限公司DHG9055A)，挤压造粒机(张家港开创机械设备有限公司ZLB-80)，水分测定仪(杭州科旭仪器有限公司OHAUSMB-35)，分析天平(杭州科旭仪器有限公司OHAUSCP64)，旋转蒸发仪(上海予华仪器有限公司NE6000)。1.1.4培养基TSM培养基：MgSO4•7H2O0.2g/L、KH2PO40.9g/L、KCl0.15g/L、NH4NO31.0g/L、葡萄糖3g/L、氯霉素0.25g/L、甲基磺0.3g/L、五氯硝基苯0.2g/L，玫瑰红0.15g/L、琼脂20g/L。

1.2实验方法

1.2.1制剂中木霉菌分生孢子含量的测定按TSM平板菌落计数法，分别取1g样品，加入含有9mL0.1%吐温-80的无菌水试管中，在涡旋振荡器上震荡均匀，用移液器从试管中部吸取孢子悬浮液1mL转移到下一个试管中，依次稀释并配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9孢子悬液。用移液器分别从不同梯度的试管中吸取并转移1mL孢子悬液到培养基平板上，用曲玻棒涂布均匀。每个处理重复3次。将平板放入25℃的培养箱培养72h，统计平板木霉菌菌落数，根据稀释倍数计算样品中木霉菌分生孢子的浓度(cfu/g)。

1.2.2木霉菌样品水分的测定方法使用MB-35水分测定仪，设置烘干温度100℃，放入0.500g样品进行测定，每份样品有做4个平行，记录数据。

1.2.3填料、助剂与木霉菌相容性测定填料(硅藻土、滑石粉、高岭土、膨润土)分别以100、250、500g/L的质量浓度与PDA培养基混合摇匀后，润湿分散剂(十二烷基硫酸钠、木质素磺酸钠、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐、拉开粉)、崩解剂(氯化钠、硫酸钠、尿素)分别以5、10、50g/L的质量浓度与PDA培养基混合摇匀后，121℃灭菌20min，冷却至60℃后倒入培养皿，用不含填料或助剂的PDA培养皿作为空白对照。用灭菌打孔器取直径为2.5mm的Tr309T的菌块，接种到上述不同处理的PDA平板的中心，每个处理有3个平行，在28℃下避光的培养箱中培养48h后测量菌落直径，取平均值，并按以下公式计算菌落生长抑制率。菌落的生长抑制率(%)=[空白对照PDA的菌落直径-加有填料(助剂)PDA上的菌落直径]/空白对照PDA的菌落直径。

1.2.4填料、助剂最佳混合浓度筛选实验根据以上对填料和助剂与木霉菌相容性的筛选结果和使用质量浓度范围，选出相容性较好的润湿分散剂、崩解剂、黏结剂。通过4因素3水平的正交试验，筛选填料、助剂最佳混合浓度的添加配比，具体操作方案与结果见表3。

1.2.5悬浮率的测定根据GB/T14825农药可湿性粉剂悬浮率测定方法，称取样品1g，倒入含250mL水的量筒中，盖上塞子，以量筒中部为轴心，将量筒上下颠倒30次/min，打开塞子，静置30min后，在10~15s内用吸管将225mL悬浮液移出。测定留在量筒底部的25mL悬浮液中的孢子量。

1.2.6润湿时间的测定根据GB/T5451—2001农药可湿性粉剂润湿时间测定方法，取(100±1)mL标准硬水，注入250mL烧杯中，称取(5±0.1)g的试样，置于表面皿上，将全部试样从与烧杯口齐平的位置一次性均匀地倾倒在该烧杯的液面上，但不要过分地扰动液面。加试样时立即用秒表记时，直至试样全部润湿为止。记下润湿时间(精确至秒)。如此重复5次，取其平均值，作为该样品的润湿时间。

1.2.7崩解时间的测定用100mL的锥形量筒装入98mL的水，然后放入1g的样品，把口封住，以量筒的中间部位为中轴，以8r/min的速度进行旋转，同时开始记录时间，直到无可见颗粒时为止，即为崩解时间。

1.2.8制剂中分生孢子萌发率的测定根据1.2.1的检测方法进行检测，统计平板木霉菌菌落数，计算萌发的孢子量。同时用血球计数器对稀释为10-3孢子悬液进行镜检计数，重复取样3次，取其平均值，按照以下公式计算分生孢子萌发率。萌发率(%)=平板分生孢子计数量/镜检分生孢子计数量×100

1.2.9制剂生产过程的工艺优化本试验的造粒操作是采用开创ZLB-80型挤出式造粒机。将各助剂称量好。细度达到44μm以上，将原粉加入黏结剂水溶液混匀后，在加入助剂、载体补足100%，搅拌混匀捏合至可塑形状后，选择0.8mm孔径网筛，挤出造粒，在35℃烘干室内烘至6%含水量，得到木霉菌Tr309T水分散粒剂产品。

1.2.10不同干燥温度对木霉菌分生孢子萌发率的影响优化将所得的木霉菌水分散粒剂取样15次，分别称取15~20g样品(精确到0.002g)，缓慢加入到予华NE6000-2旋转蒸发仪的旋蒸瓶中，水浴锅的温度依次设定为30、35、40、45、50℃。将旋蒸瓶的转速设定为40r/min，真空泵的真空度调节为-0.1MPa并稳定。将样品水分蒸发至6%时，取出样品，并分装于安瓿瓶中，放置于恒温25℃贮存。每隔1个月跟踪检测木霉菌孢子的萌发率(检测方法见1.2.6)。

1.2.11不同最终含水量对木霉菌孢子萌发率影响优化将所得的木霉菌水分散粒剂取样15次，分别称取15~20g样品(精确到0.002g)，缓慢加入到旋转蒸发仪的旋蒸瓶中，水浴锅的温度控制为最佳真空干燥温度，将旋蒸瓶的转速设定为40r/min，真空泵的真空度调节为-0.1MPa并稳定。将样品水分依次蒸发至2%、4%、6%、8%、10%时，取出样品分装于安瓿瓶中，放置于恒温25℃贮存。每隔1个月跟踪检测木霉菌孢子的萌发率(检测方法见1.2.8)。

1.2.12数据分析所有试验均重复3次，计算平均值(n=3)，将所得相关试验数据用SPSS17.0版本软件对其进行ANOVA统计分析。

2结果与分析

2.1不同填料与木霉菌株Tr309T的相容性测定不同填料与木霉菌株Tr309T的相容性测试结果(见表1)显示，硅藻土A和B与木霉菌株Tr309T的相容性较其他填料与Tr309T的相容性高。在使用量为100g/L和250g/L时，硅藻土A和B对Tr309T的生长抑制率都为0%，在使用量达500g/L时，对Tr309T的生长抑制率仅分别为17.1%和5.4%，显著低于(P≤0.05)滑石粉、膨润土和高岭土对Tr309T的生长抑制率(分别为35.8%、88.2%和27.6%)，虽然当使用量为100g/L和250g/L时，滑石粉和高岭土对Tr309T的生长抑制率仅分别为0%和2.7%以及0%和8.6%，显著低于(P≤0.05)膨润土对Tr309T的生长抑制率(分别为3.2%和33.2%)。

2.2不同助剂与木霉菌分生孢子相容性测定结果当助剂使用量达到50g/L时，十二烷基硫酸钠、拉开粉对木霉菌分生孢子的抑制率达到100%，显著高于NNO对分生孢子的抑制率(28%)。因此确认NNO为Tr309T水分散粒剂的润湿分散剂，使用量为5%~10%。当崩解剂的使用质量浓度为5g/L时，各崩解剂对Tr309T均无明显的抑制效果，而质量浓度达到50g/L时，尿素、硫酸铵对Tr309T抑制效果显(分别为38%、22.7%)著高于氯化钠(19.8%)对Tr309T抑制效果，因此选用氯化钠作为崩解剂且使用量为5%~10%。当黏结剂的使用浓度为5g/L时，各黏结剂对Tr309T均无明显的抑制效果，而质量浓度达到50g/L时，淀粉、葡萄糖、糊精对Tr309T抑制效果(分别为31.5%、32.5%、29.3%)显著高于甲基纤维素(7.5%)对Tr309T抑制效果，因此选用甲基纤维素为崩解剂且使用量为10%~15%。

3制剂生产过程中的工艺优化结果

3.1填料、助剂最佳混合浓度配方筛选根据L9(34)正交试验的极差分析，针对润湿时间，极差值显示RB＞RA＞RC，说明润湿分散剂对润湿时间的影响是最大的；针对悬浮率，极差值显示RB＞RA＞RC，说明润湿分散剂对悬浮率的影响也是最大的；针对崩解时间，极差值显示RC＞RA＞RB，说明崩解剂对崩解时间的影响是最大的。根据各指标的实验结果，确定各因素的最优水平组合：对于润湿时间，最优组合是A1B3C3；对于悬浮率的最优组合是A2B3C3；对于崩解时间，最优组合是A1B2(B3)C3。黏结剂含量选择A2时，悬浮率比黏结剂含量选择A1时高了8.3%，崩解时间快了2.7s。因此根据综合平衡法，最终确定水分散粒剂的填料、助剂最佳混合浓度配方为A2B3C3(见表3)。

3.2制剂生产过程中的工艺优化

3.2.1干燥温度对木霉菌孢子萌发率影响的优化根据实验要求，定期对不同温度烘干的制剂样品，进行木霉菌分生孢子存活率与后期萌发率跟踪检测(见图1、2)。对不同烘干温度所得的Tr309T水分散粒剂进行检测，30、35℃的初始存活率在95%以上，40、45℃的初始存活率在90%，而50℃的初始存活率仅80%。对Tr309T水分散粒剂在40、45、50℃的温度下烘干并存储9个月后，分生孢子的萌发率近于0%。然而经30℃和35℃烘干处理并6个月后，制剂中分生孢子的萌发率分别为56%和81%，直到存储至11个月后，萌发率为0%。

3.2.2制剂最终含水量对木霉菌孢子萌发率影响的优化根据以上干燥实验结果，选择出最佳的烘干温度(35℃)，用此温度，将样品水分依次烘干到2%~10%，并定期对制剂样品进行木霉菌分生孢子萌发率跟踪检测(见图3)。从图中可以观察到，当最终含水量为2%时，在初期检测时Tr309T水分散粒剂的颗粒的萌发率也只有68%左右，而含水量在8%、10%，分别在第3、5个月检测时，检测平板已经出现了染菌现象。而水分维持在6%时，在6个月内萌发率均达到80%以上。根据最佳配方的配比，按照调整的生产工艺路线，得到Tr309T水分散粒剂。根据各项质量检测的方法，得到Tr309T水分散粒剂的孢子含量为2.03×108，水分含量为6.03%，悬浮率为78.6%，润湿时间为46.7s，崩解时间为55.7s。

4讨论与分析

水分散粒剂是一种比可湿性粉剂更安全更适用的新剂型。研究和开发水分散粒剂，完全顺应了微生物农药剂型加工逐渐从液体制剂向固体制剂，从粉末制剂向颗粒状制剂方向发展的趋势。汤坚等[13]研究了15种不同的载体对球孢白僵菌孢子粉孢子的萌发率、产孢量和菌落生长速度的影响，从中筛选出了高岭土、滑石粉、硅藻土等一些惰性矿物质材料可作为白僵菌制剂的载体，但是不同的惰性物质对木霉菌的活力影响不尽相同。本文将菌株Tr309T分别与不同的填料载体进行相容性测试，选择了相容效果较佳的硅藻土B作为载体。因为硅藻土对木霉菌分生孢子萌发的影响较小，适用于木霉菌水分散粒剂。张拥华等研究中发现木质素磺酸钙对粘帚菌孢子活力无明显影响。Jin等在优化白僵菌非离子表面活性剂时设计了表面活性剂的添加对白僵菌萌发影响的研究，选择对白僵菌萌发影响小的表面活性剂类型。活体微生物农药助剂的选择要谨慎，需要增加其他实验来确定助剂自身对活体有效成分是否存在影响。杨合同在其研制的木霉制剂中添加十二烷基硫酸钠作为润湿分散剂。本研究中发现，当十二烷基硫酸钠的添加质量浓度仅为5g/L时，对Tr309T分生孢子的萌发抑制率可达84%以上，而在此浓度下使用2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐，对Tr309T分生孢子的萌发抑制率仅为7%左右。因此，在制作木霉菌水分散粒剂时，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐是一种较适合使用的润湿分散剂。Sargin等对哈茨木霉菌EGE-K38固体发酵生产的分生孢子进行的干燥温度测试，在40℃烘干24h，孢子产量最高。Jin等对哈茨木霉菌进行微胶囊化处理时，喷雾干燥设备最佳的进/出口温度设定为60/31℃。这说明在不同的烘干温度下，木霉菌分生孢子对温度的耐受力时间不同，并随着烘干温度的升高，分生孢子对此温度的耐受时间就会相应的降低。本文作者据此对Tr309T水分散粒剂的烘干温度与终含水量进行了梯度处理，最终选择出对Tr309T水分散粒剂的分生孢子的最佳烘干温度为35℃和制剂终含水量为6%。

木霉菌对外界环境条件的变化很敏感，造成了木霉菌制剂贮存期稳定性差和货架期短等问题。SARGIN等发现在喷雾干燥过程中使用甘油作为哈茨木霉菌分生孢子的微胶囊化保护剂，可以有效的延长干燥和贮存过程中分生孢子的存活率。在开发木霉菌生物制剂的过程中，对制剂配方材料的筛选、生产成本的控制以及如何保持木霉菌孢子的货架期，都是必需考虑和解决的问题。本文在选用合适的填料和不同功能的助剂，制剂加工过程中干燥温度和成品制剂的含水量以及制剂中活体有效成分货架期所做的测试及对制剂配方的筛选和生产工艺的优化有至关重要的作用。使制备的Tr309T水分散粒剂中分生孢子的存贮时间得到延长，为木霉菌水分散粒剂的开发提供了可参考的实验依据和思路。

作者：谢俊 旷文丰 陈娟 毛伟力 单位：海万力华生物科技有限公司