污染对土壤水解酶活性的影响范文

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《农业资源与环境学报》2015年第三期

1材料与方法

1.1土壤样品土壤采自我国西北地区某市的农田表层土壤，选取具有代表性的5个采样点，均采取0～20cm的样品，混合均匀后带回实验室。在洁净实验室内展开、风干，挑拣其中的植物、残根、石块及其他杂物。用木碾研磨过18目筛子。处理后的土样装入密封袋中密封保存，备用。土壤样品的主要理化性质见表1。

1.2实验设计选取转化酶、脲酶、碱性磷酸酶活性为指标，Cu、Zn、Pb和培养时间作为因素。实验因素和水平设计列于表2。外源污染物Cu、Zn、Pb复合作用对3种水解酶活性的影响选用5因素4水平的L16(45)型正交表(实验1)，在对各因素主效应分析之后，选取Cu、Zn、Pb三因素重新排定L8(27)正交表，用以考察三种污染物之间的交互作用对酶活性的影响(实验2)。指标水平参照土壤环境质量标准(GB15618-1995)，Cu、Zn、Pb分别以CuSO4•5H2O、Zn(CH3COO)2•3H2O和Pb(CH3COO)2•3H2O溶液形式加入，充分搅匀，加水使土壤湿度保持在土壤最大持水量的60%，置于培养箱内25℃黑暗恒温恒湿培养，每个处理做3份平行。

1.3测定方法土壤pH值：酸度计法；土壤有机质：重铬酸钾法；阳离子交换量：氯化钡法；重金属：电热板湿法消解-ICP-AES法；转化酶活性测定：3,5-二硝基水杨酸比色法，大小用24h，1g干土生成的葡萄糖毫克数表示；脲酶活性测定：苯酚钠—次氯酸钠比色法，大小以24h，1g干土的氨氮毫克数表示；碱性磷酸酶活性测定：磷酸苯二钠比色法，大小以24h，1g干土生成的酚毫克数表示（以上酶活性测定时均设3份平行，以及用水代替基质的对照样品和无土对照样品，以排除土壤和试剂中杂质的干扰）。数据使用Excel2010和Spss18.0进行分析。

2结果与分析

2.1Cu、Zn、Pb复合作用对土壤水解酶活性的影响通过观察法获得的平均值（表3）可知，转化酶活性、脲酶活性及碱性磷酸酶活性的最大值分别出现在实验3、实验1和实验1。对不同因素而言，分析每个水平上三种水解酶的平均值，转化酶活性、脲酶活性及碱性磷酸酶活性的最大值分别出现A1B1C4D3，A1B2C3D1及A1B1C1D3，并且A1B1C1D3与观察法的结果一致。方差分析结果显示（表4），在95%置信区间下，Cu对三种水解酶活性有显著影响，Zn和Pb对三种水解酶活性影响不显著。Cu对三种水解酶活性影响程度脲酶＞碱性磷酸酶＞转化酶。

2.2Cu、Zn、Pb的交互作用及各自主效应对土壤酶活性的影响表5是观察法的分析结果，转化酶、脲酶和碱性磷酸酶活性的最大值分别出现在实验6、实验4和实验1。分析每个水平水解酶活性总和的平均值，转化酶、脲酶和碱性磷酸酶活性的最高值是A2B2C2，A1B2C2及A1B1C2。A1B2C2与观察法结果一致，其他两个值与观察法结果相近。方差分析结果显示（表6），这些因素与转化酶活性关系不显著；Cu和Zn对脲酶活性有显著影响(p＜0.05)，Cu×Zn在p＜0.10时对脲酶活性有显著影响；其他因素，如Pb，Cu×Pb，Zn×Pb与脲酶活性之间无显著差异。然而，在95%置信区间下，除了Zn×Pb，其他因素与碱性磷酸酶活性之间均有明显差异。图1~3是添加到土壤样品中重金属浓度与土壤酶活性之间的关系图。从图1可以看出，样品的三种土壤酶活性都比参考样品(没有添加外源重金属)酶活性低。Cu对脲酶和碱性磷酸酶活性影响具有相同的规律，即随着Cu浓度的增加，土壤酶活性显著降低，并且在Cu浓度从100增加到400mg•kg-1时，碱性磷酸酶活性急剧下降。Cu浓度为400mg•kg-1时，脲酶活性和碱性磷酸酶活性分别是对照样品酶活性的49%和56%。当Cu浓度小于35mg•kg-1时，转化酶活性受到明显抑制作用，从35增加到100mg•kg-1时，酶活性轻微降低；当Cu浓度从100增加到400mg•kg-1时，酶活性显著降低。图2展示的是添加Zn以后三种水解酶活性表现出的不同变化规律。在Zn的浓度为500mg•kg-1时，转化酶活性和碱性磷酸酶活性均比对照样品酶活性降低，分别是对照样品酶活性的97%和91%，而脲酶活性有所增加，是对照样品的107%。首先，低浓度的Zn抑制转化酶活性，随后又表现出激活特性，当Zn浓度从300增加到500mg•kg-1时，酶活性有缓慢的增加；脲酶活性表现出不同的变化趋势，从最初显著增加到无明显变化。通常Zn对碱性磷酸酶活性表现出抑制作用。Zn对转化酶活性和脲酶活性的强化效应可能与它们是金属酶有关，并且该金属是Zn[3]。图3描述的是三种土壤水解酶活性对添加的外源Pb的响应。总体看，在Pb浓度为500mg•kg-1时，转化酶活性和脲酶活性均比对照样品升高，而碱性磷酸酶活性降低，是对照样品酶活性的87%。在低浓度时，Pb抑制转化酶活性，激活脲酶活性。在浓度从35增加到500mg•kg-1时，转化酶活性随Pb浓度增加而升高，而随后转化酶活性显著降低；脲酶活性随Pb浓度增加表现出不同的变化规律，当Pb浓度从35增加到350mg•kg-1时，酶活性降低，从350增加到500mg•kg-1时，酶活性显著增加；Pb则是碱性磷酸酶活性的抑制剂。不同的培养时间对酶活性也有一定的影响。在7到14天时，随培养时间的延长，转化酶活性和碱性磷酸酶活性表现出相同的变化趋势，即酶活性先升高，后降低。对脲酶活性而言，在第7天时有显著降低，随后随时间延长缓慢降低。水解酶活性与所添加的外源污染物的量之间的多元回归方程(式1~3)显示的信息与以上分析结果类似。从碱性磷酸酶活性与各污染因素添加量之间的多元回归方程可见，Cu、Zn、Pb的回归系数分别为-2.152、-0.451及-0.831，各因素对酶活性均表现为抑制作用，并且对酶活性影响的顺序是Cu＞Pb＞Zn。另外，Zn和Pb对脲酶活性表现出激活作用，而Zn对转化酶活性几乎没有影响，这些结论与以前的研究成果一致，同时与方差分析的结果相符。

3讨论

复合重金属对土壤酶活性的影响早有报道。本研究发现，与其他污染物相比，Cu可明显抑制土壤水解酶活性，并且抑制程度随金属Cu的含量增加而增大。Zn对转化酶活性和脲酶活性没有明显作用，不过Zn浓度为100mg•kg-1时可提高脲酶活性。然而，随着添加Zn量的增加碱性磷酸酶活性受到抑制。其实Cu、Zn和Pb对碱性磷酸酶活性均表现出抑制作用。重金属抑制土壤酶活性的机理有几种方式，包括使酶的催化活性基团失活、使蛋白质变性以及与那些形成酶-底物复合物所必需的金属离子竞争等[15]。Wang等发现土壤磷酸酶活性与金属Cu之间呈显著的负相关关系。Khan等指出重金属可与酶的巯基反应，形成金属-硫化物等同物进而抑制和/或使酶活性失活。抑制剂可通过改变酶的分子结构进而抑制脲酶活性。另外一些学者研究认为当重金属含量达到2000mg•kg-1时，脲酶活性可完全消失。Zeng等也指出，通常在特定的环境条件下，某些元素的含量超过某一范围时会对植被和微生物带来负面效应。另外，不同种类的酶对重金属含量变化带来的响应也不同。这可能取决于酶的灵敏度、酶结构上的抑制以及季节影响。同时，土壤因素，如pH、土壤有机质含量和粘土矿物成分也会有一定的影响。Wyszkowska等指出土壤酶活性对重金属影响的灵敏度排序是脱氢酶＞脲酶＞碱性磷酸酶。当重金属进入土壤，它们可以改变土壤pH值，一般是导致土壤酸化。Renella等认为在碱性土壤中，酸性磷酸酶活性更易受影响，而碱性磷酸酶活性在酸性土壤中更易受影响。除此之外，重金属抑制土壤酶活性的机理可能是钝化催化活性基团，与那些可以形成酶-底物复合物的重金属离子竞争，或者是使蛋白质成分失活。培养时间对三种土壤水解酶活性也表现出不同的影响。不过在第35天时所有的土壤酶活性均比第3天时低，这个结果与Naidu等的结论一致，即随着重金属在土壤中时间的延长，重金属的生物可利用性降低。因为重金属的生物利用率是土壤酶活性的主要来源，有其是对土壤微生物和植物。当三种重金属同时存在时，他们对酶活性影响的强度并不是他们单独存在时对酶活性影响程度之和，这可能是与同一个实验中的三种重金属之间发生了相互作用有关。在我们国家，土壤中重金属的主要来源有污水灌溉、工业废弃物堆放、城市固体垃圾堆放以及大气沉降等。刘树庆发现在保定市污水灌溉的农田中Zn、Cu、Pb和Cd的含量非常高，并且随着持续的污水灌溉金属含量一直在增加。另外，由于土壤存在多种重金属复合污染，其中种植的蔬菜也应经被污染。在该研究中，很少有人指出土壤中Cu、Zn、Pb的含量已接近污染的水平。有交互作用的实验结果显示，三种重金属复合效应对碱性磷酸酶活性影响最显著，尤其是Cu×Pb，其次是Cu×Zn。不过它们的这些影响都不及Cu单独存在时显著。Wyszkowska等曾有过类似的报道，他发现当Cu与其他重金属（如Zn、Pb、Cd和Cr）同时存在时，它对土壤酶活性的抑制作用比它单独存在时弱。对于此现象，其他解释是当两种重金属同时作用时(Cu×Zn,Cu×Pb)，Zn或Pb对土壤酶活性有保护作用。与Zn、Pb的自主效应比较，两者的复合效应降低了，这说明它们对碱性磷酸酶活性的影响具有拮抗作用。尽管Cu或Zn对转化酶活性有轻微影响并且没有统计显著性，不过它们的复合效应影响增加了，这说明在它们的二元系统中存在协同效应。不过，二元系统对碱性磷酸酶活性的抑制作用没有它们单独存在时显著，这可能是由于二者之间存在负的协同抑制效应。总之，添加的Cu、Zn、Pb对研究的三种土壤水解酶活性均呈现不同的影响。土壤酶活性被抑制或激活的程度随重金属种类及其浓度以及土壤酶种类的不同而有差异。一些学者报道土壤酶受到抑制或激活的程度顺序与众多因素有关，包括重金属种类、重金属浓度、分析的土壤酶种类；溶液中重金属与土壤酶官能团之间的反应；重金属之间的反应；土壤的理化性质，如pH、阳离子交换量、有机质含量，以及粘土矿物种类和含量等。这些过程可能导致土壤中不同重金属对土壤酶活性抑制或激活效应的不同。这些结果与其他的一些将土壤酶活性作为土壤重金属污染指示剂的研究结论一致。

4结论

以正交实验设计方案为基础的该研究证实了土壤中添加的外源重金属Cu、Zn、Pb，不管是三者的复合作用还是两两之间的相互作用，都对土壤水解酶活性产生了影响。(1)当Cu、Zn、Pb三种重金属同时存在土壤样品中时，金属Cu对三种土壤水解酶活性的抑制作用较其他两种金属显著，对碱性磷酸酶抑制作用的排序是Cu＞Zn＞Pb。(2)考虑三种土壤水解酶，在本研究中碱性磷酸酶活性对三种重金属的交互作用影响反应最敏感，尤其是Cu×Pb，因此可以考虑将碱性磷酸酶活性作为土壤重金属Cu污染程度的指示剂。

作者：冯丹 王金生 滕彦国 单位：北京师范大学水科学研究院 地下水污染控制与修复教育部工程研究中心