高效液相色谱法检测环氧虫啶范文

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《农药学学报》2016年第二期

摘要：

建立了环氧虫啶在柑橘和土壤中残留量测定的高效液相色谱(HPLC-UVD)分析方法。柑橘样品采用V(蒸馏水)∶V(二氯甲烷)=1∶2提取后经弗罗里硅土柱净化(土壤样品提取后直接测定)，HPLC-UVD测定，外标法定量，并运用此方法对田间样品进行了环氧虫啶残留量检测验证。结果表明：在0.05~5mg/L范围内，环氧虫啶质量浓度与对应的峰面积间呈良好线性关系，线性方程为y=10243x+233.0(R2=0.9990)；土壤和柑橘中环氧虫啶的最低检测浓度均为0.1mg/kg；在0.1~1mg/kg3个添加水平下，环氧虫啶在土壤和柑橘中的平均回收率在76%~93%之间，相对标准偏差(RSD,n=5)在1.6%~5.8%之间。该方法快速、灵敏、稳定，可用于柑橘和土壤中环氧虫啶残留量的检测。

关键词:

高效液相色谱；环氧虫啶；柑橘；土壤；残留

环氧虫啶(cycloxaprid)，化学名称为9-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-4-硝基-8-氧杂-10,11-二氢咪唑并[2,3-a]双环[3,2,1]辛-3-烯)，化学结构式见图式1，是中国华东理工大学和上海生农生化制品有限公司联合开发的一类顺硝烯氧桥杂环新烟碱类杀虫剂，主要用于半翅目害虫如稻飞虱、蚜虫、烟粉虱等的防治[1]，其作用机理与之前的新烟碱类杀虫剂有着本质的区别，是国际上首个nAChR抗结剂[2-3]。Shao等[4]的研究表明，环氧虫啶和蚍虫啉对蚜虫的LC50值分别为0.00471和0.3502mmol/L，对粘虫的LC50值分别为0.03873和0.12549mmol/L，环氧虫啶活性显著优于吡虫啉。环氧虫啶对哺乳动物的急性毒性属低毒，低于传统的新烟碱类杀虫剂，对非靶标生物如水蚤类、鱼类、土壤微生物和其他植物的影响甚微，对蜜蜂的毒性与吡虫啉相比也显著降低[5-6]，极有可能成为国际上具有重要影响力的新一类杀虫剂。目前，对环氧虫啶的研究主要集中在生物活性[7-10]、作用方式[11-12]和环境行为[13-18]等方面。根据国际上农药残留物定义，环氧虫啶在柑橘中的残留是必检项目[19]，而有关环氧虫啶在环境基质中残留量的分析方法研究甚少[20-21]。目前未见文献报道环氧虫啶在柑橘土壤、橘皮、橘肉、全果中残留的检测方法，国际上也未制定食品中环氧虫啶的MRL值[22-23]。故笔者以水-二氯甲烷为提取剂，柑橘样品超声提取后经弗罗里硅土柱净化(土壤样品提取液直接测定)，建立了环氧虫啶残留的HPLC-UVD检测方法，并应用该方法对25%环氧虫啶可湿性粉剂在田间柑橘和土壤样品中的残留量进行了检测，以期为环氧虫啶在环境中的残留监测提供科学依据。

1材料与方法

1.1仪器与药剂LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司，带紫外检测器和LCsolution化学工作站)；RE-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DLSB-5L/25低温冷却液循环泵、玻璃仪器气流烘干器及SHZ-D(III)循环水式真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)；JYL-B062九阳料理机(九阳股份有限公司)；TD5A台式高速离心机(长沙英泰离心机仪器有限公司)；BOMEX层析柱(1.5cm×20cm，天津市天波玻璃仪器有限公司)。99.5%环氧虫啶(cycloxaprid)标准品(农业部农药检定所)；25%环氧虫啶可湿性粉剂(上海生农生化制品有限公司)，乙腈(色谱纯)；娃哈哈饮用纯净水；无水硫酸钠、二氯甲烷和乙腈(分析纯)；60~100目弗罗里硅土(150~250μm，650℃下烘烤3h，加5%蒸馏水脱活后使用)。

1.2检测条件InertsilODS-SP色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为V(乙腈):V(水)=60:40；流速0.6mL/min；检测波长348nm；柱温40℃；进样量20μL。

1.3样品的提取与净化

1.3.1提取土壤样品去掉砂石和植物残体，研碎过20目筛(粒径850nm)，四分法缩分留样250g。柑橘全果、橘肉和橘皮分别切碎、匀浆，四分法缩分，留样250g。分别准确称取土壤、柑橘全果、橘肉和橘皮样品各10g(精确至±0.1g)于250mL具塞三角瓶中，分别加入10mL蒸馏水和20mL二氯甲烷，静置20min后超声提取20min；将柑橘样品提取液转移至离心管中，于3600r/min下离心5min，取有机相10mL，于45℃下旋蒸浓缩至近干，待净化。土壤样品提取液用色谱纯乙腈定容到2mL，过0.45μm有机滤膜，按1.2节条件测定。

1.3.2净化参照文献[24-25]并加以改进：分别将2mL分析纯乙腈加入柑橘全果、橘肉和橘皮提取液并转移至已制备好的弗罗里硅土层析柱(从下至上依次装填有少许脱脂棉、2g无水硫酸钠、5g弗罗里硅土、2g无水硫酸钠)中；先用10mL分析纯乙腈预淋洗，弃去淋洗液，再用40mL分析纯乙腈少量多次洗脱，收集全部洗脱液，于45℃下旋蒸浓缩至近干，用色谱纯乙腈定容到2mL，过0.45μm有机滤膜，按1.2节的条件测定。

1.4标准溶液的配制及标准曲线绘制准确称取环氧虫啶标准品0.025g(精确至±0.0001g)，用色谱纯乙腈溶解并定容至50mL，配制成500mg/L的标准品母液，于4℃贮存，备用。试验时再用色谱纯乙腈梯度稀释，配成质量浓度分别为0.05、0.5、1、2和5mg/L的标准工作溶液，按1.2节条件测定。采用外标法定量。以进样质量浓度为横坐标、相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5添加回收试验在0.1、0.5和1mg/kg3个添加水平下，每个水平重复5次，按1.3节方法进行样品前处理，按1.2节条件测定。

1.6田间试验试验于中国湖南长沙市进行。分别设推荐使用剂量和高剂量两种施药量，即按25%环氧虫啶可湿性粉剂对水稀释2000倍液(有效成分为125mg/kg)和1333倍液(有效成分为187.5mg/kg)，选择从未施用过环氧虫啶的地块中树龄为5a左右、长势良好的柑橘树进行试验。对每小区柑橘树喷雾施药2~3次，以柑橘叶和果实有药液开始滴落为度，施药间隔期为10d，每处理重复3次。分别距最后一次施药10、20和30d于每小区随机选取10个点以上，采集0~15cm的土壤样品约2kg，以及随机按上、下、内、外、向阳和背荫方向采集柑橘样品2kg，于–20℃贮存，备用。

2结果与讨论

2.1方法的线性范围及检出限结果表明：在0.05~5mg/L范围内，线性方程为y=10243x+233.0(R2=0.9990)，表明环氧虫啶质量浓度与对应的峰面积间呈良好的线性关系。环氧虫啶在柑橘全果、橘肉、橘皮和土壤样品中的最低检测浓度均为0.1mg/kg。

2.2方法的准确度与精密度结果(表1和图1)表明：在0.1、0.5和1mg/kg3个添加水平下，环氧虫啶在土壤及柑橘中的平均回收率在76%~93%之间，相对标准偏差在1.6%~5.8%之间，均符合农药残留分析方法的技术要求[26]。

2.3色谱条件的优化由于环氧虫啶标准溶液在348nm处有最大吸收峰，故选择348nm作为检测波长。分别以乙腈-水、甲醇-水不同比例作为流动相，综合考虑环氧虫啶的保留时间及峰形，最终确立以V(乙腈):V(水)=60:40为流动相，流速为0.6mL/min，柱温40℃。环氧虫啶标准溶液色谱图见图2。在此检测条件下，以3倍信噪比计，仪器对环氧虫啶的最小检出量为1ng。由图2可看出该方法对环氧虫啶具有较好的分离效果。

2.4提取剂选择和提取条件的优化根据环氧虫啶的极性与溶解性，分别考察了以二氯甲烷、丙酮、乙腈、二氯甲烷-水、二氯甲烷-氯化钙为提取剂，同时分别采取超声、水浴振荡和恒温振荡等提取方式对比提取效果。结果表明：采用各单一提取剂均不能满足农药残留检测技术要求，其中二氯甲烷、丙酮和乙腈提取率分别为45.3%、47.8%和48.4%。考虑到乙腈对实验者的危害和成本较高等问题，丙酮提取色素较多对目标化合物的峰形干扰较大，故选择二氯甲烷作为土壤样品的提取剂，且添加10mL的蒸馏水后[21]，其回收率接近90%，故最终选取V(蒸馏水):V(二氯甲烷)=1:2为提取剂(表2)。此外，采用振荡提取方式提取土壤样品时，提取效果不理想，而采用超声波提取却获得了较好的提取效果，故选择超声波提取。柑橘样品采用了与土壤样品相同的前处理方式，但因柑橘样品中的共提杂质较多，干扰目标化合物的峰形，因此需进一步净化。

2.5净化方法的优化

2.5.1层析柱的选择结果表明：采用中性氧化铝层析柱净化柑橘样品时，杂质与目标化合物均被吸附，未检测到目标峰；而用弗罗里硅土柱净化时，杂质与环氧虫啶分离效果好且回收率达100.2%，达到农药残留检测与分析的要求[26]。

2.5.2洗脱液体积的确定由图3淋洗曲线可知：大部分环氧虫啶集中在前40mL淋洗液中，回收率达到99%以上，从收集的第5个10mL淋洗液中仅检测出极少量的环氧虫啶，第6个10mL淋洗液中未检出环氧虫啶，综合考虑，最终确定采用40mL洗脱。

2.6方法的应用笔者采用本研究建立的分析方法，于2014年在中国湖南长沙进行了环氧虫啶残留的田间试验。对采集于不同环氧虫啶施药剂量、不同施药次数下柑橘果园里的柑橘和土壤样品进行了环氧虫啶残留量检测，结果(表3)表明该方法符合农药残留检测的要求[26]。

3结论

本研究建立了柑橘及土壤中环氧虫啶残留量的高效液相色谱检测方法，样品采用蒸馏水-二氯甲烷超声提取；柑橘样品经弗罗里硅土层析柱净化，HPLC-UVD测定；土壤样品提取后无需净化直接测定。该方法准确性好、精密度高，与陈敏[20]的土壤提取方法相比，具有操作简便、省时、成本较低等优点。本研究结果可为环氧虫啶在柑橘作物上的安全性评价及在其他农作物中的残留检测方法研究提供参考。

作者：聂红英 杨仁斌 赵运林 吴育佳 欧阳文森 单位：湖南农业大学 农业环境保护研究所 湖南农业大学 生物科学技术学院 杭州师范大学 生命环境与科学学院