草铵膦对斑马鱼胚胎的毒性研究范文

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《农药学学报》2016年第二期

摘要：

草铵膦(glufosinate-ammonium，GLA)是一种广谱触杀型非选择性除草剂，随着在生产中应用的不断增加，其生物安全性也越来越受到人们的重视。试验以斑马鱼Daniorerio胚胎为动物模型，用不同剂量的草铵膦染毒受精后2h的斑马鱼胚胎，观察其死亡率和形态学变化，并应用原位杂交和QRT-PCR技术检测了Vasa基因表达情况，以分析草铵膦的毒性作用。结果表明：1.6μg/L的草铵膦对斑马鱼胚胎有显著致死作用、1.3μg/L的草铵膦有显著致畸作用，其中畸形表现为尾部弯曲和阻碍黑色素沉着。原位杂交结果显示：1.3μg/L的草铵膦可引起Vasa表达的部分缺失，QRT-PCR定量分析发现，草铵膦可引起斑马鱼胚胎Vasa基因表达水平下调3.8倍。表明草铵膦对斑马鱼胚胎有较强的致死毒性、致畸作用和潜在的生殖毒性。

关键词:

草铵膦；斑马鱼；毒性评价；Vasa基因

草铵膦[(glufosinate-ammonium，图式1)，化学名称为4-(羟基(甲基)膦酰基)-DL-高丙氨酸]，是由德国赫斯特公司(现为拜耳公司下属企业)于20世纪80年代创制的有机磷类广谱触杀型非选择性除草剂，最早于1984年在日本获得登记。草铵膦也是世界第二大转基因作物耐受除草剂[1]，其特点是活性高、吸收好、杀草谱广、低毒、持效期长、环境兼容性好[2-3]，已在日本、韩国、东南亚、欧洲、美洲等国家普遍应用。“灭生性除草剂+抗除草剂转基因作物”的农业生产模式已逐渐成为农业生产发展的主流[4]。在草铵膦产量日益增长的同时，其安全性也引起了广泛关注。目前，对草铵膦的研究主要集中于其在环境中的降解、转移以及对农作物的影响等。草铵膦在土壤中活性较低、降解较快，一般降解为4-甲基膦酸亚基-2-氧代丁酸(PPO)和3-甲基膦酸亚基(MPP)，其降解及转移与土壤的黏度成分有关[5]，气候、水分和光照等条件亦会影响其降解[6]。草铵膦在杂草体内的作用靶点是谷氨酰铵合成酶(GS)，其作用机制是对GS不可逆的抑制及破坏其相关代谢过程，从而导致细胞内氨积累、氨基酸合成及光合作用受抑制、叶绿素被破坏等，进而引起植物死亡[7]。有关草铵膦在动物体内代谢动力学的研究表明，草铵膦被吸收后在大鼠全身大部分脏器均有分布，以尿液排出为主[8]。草铵膦易溶于水(溶解度为1379g/L)，并且在pH5~9的水体中不会光解[9]，因而在一些研究中草铵膦已被归为持久性污染物，其半衰期为3~42d[10]。草铵膦会抑制树蟾体内乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的活性[11]；草铵膦染毒会诱导蟾蜍蝌蚪血液红细胞微核率升高[9]。还有研究表明，草铵膦会造成人的DNA氧化性损伤[12]；在使用草铵膦的地区，通过饮食和饮水可对人体和动物造成危害[13–15]。随着草铵膦的广泛应用，其残留物对人体健康的影响越来越受到人们的重视，开展其水生生物毒性的相关研究可以评价其对水体的安全性。斑马鱼Daniorerio是目前理想的生物模型[16-17]。本研究采用草铵膦感染早期斑马鱼胚胎，通过形态学、分子生物学以及组织学等手段，观察评价了草铵膦对胚胎生长发育的影响。

1材料与方法

1.1仪器与试剂5415R型台式离心机(Eppendorf公司)；数码照相机DXM1200、倒置显微镜E600及EclipseNet图像分析软件(Nikon公司)。10%草铵膦水溶液(由Solarbio公司从德国拜耳进口分装)；阿尔新蓝；DIG抗体显色剂(BMpurple,Roche)；抗地高辛抗体(DIG,Roche)；TrizolRNA提取试剂盒(Gibco)；反转录试剂盒；肝素和酵母tRNA。阿尔新蓝染液：由0.1g阿尔新蓝、20mL醋酸和80mL95%乙醇组成。20×氯化钠柠檬酸钠缓冲液(SSC)：氯化钠17.52g，柠檬酸钠8.84g，蒸馏水80mL；用氢氧化钠调pH值至6.0，定容至100mL，高压灭菌，4℃或者室温保存。

1.2供试动物斑马鱼Daniorerio(AB系)由日本酪农学园大学赠送，饲养于北京爱生公司生产的斑马鱼养殖系统中，保持饲养水温28.5℃、光照时间为14h/d。试验前一天傍晚，随机选取3条雌鱼和6条雄鱼放在同一斑马鱼专用孵化缸中混养，于第2日8：00开灯，待其自然交配后，挑选发育正常的受精卵置于直径为3cm的六孔板中，在受精后2h进行草铵膦染毒。每个浓度10个胚胎，3次重复。染毒后移入孵化箱，于28.5℃下培养。分别于受精后24、48或120h取样观察，记录死亡和畸形胚胎个数。

1.3试验处理根据预试验结果，最终确定了6个草铵膦染毒浓度处理，分别为：空白对照、0.001μg/L(微量浓度组)、1.0μg/L(低浓度组)、1.3μg/L(有畸形但未出现死亡的浓度)、1.6μg/L(开始出现死亡个体的浓度)和2.0μg/L(全部死亡组，即高浓度组)。

1.4软骨染色参考Dong等的方法[16]。1)胚胎的固定：取受精后120h的幼鱼10条，用4%的中性缓冲多聚甲醛(PFA)于4℃下固定并过夜；2)染色：用阿尔新蓝染液染色6h；3)清洗：用75%和50%的酒精以及蒸馏水各清洗3h；4)祛黑色素：依次用0.05%的胰酶-饱和四硼酸盐和1%氢氧化钾-30%双氧水各处理1h；5)观察及保存：在70%甘油中观察及保存。

1.5原位杂交及定位Vasa探针的制备采用68~509pbHSP90a的片段，引物分别为5′-CCGCAGGTGGAGAAGAGGA-3′和5′-GACAGTGAACGATCCGCCA-3′。将扩增后的基因片段插入pGEM质粒中，经过筛选、扩增、测序、酶切和纯化后，在DIG标识的dNTP和T7或者SP6Ploymerase(Roche)存在的情况下，合成各自的探针。原位杂交按Dong等[16]的方法进行。取受精后24h的胚胎，于4℃下用4%的PFA固定12h；用蛋白酶K(1.0×10–6mol/L)于室温下消化30min；加入原位杂交液(50%甲酰胺，5×SSC，2g/LtRNA，200μg/mL肝素)，于64℃恒温箱中培养1h(预杂交)；用含有斑马鱼Vasa基因探针的原位杂交缓冲液更换过夜；分别用2×SSC、0.2×SSC在64℃加热器中各清洗30min，再用顺丁烯二酸缓冲液(0.1mol/L顺丁烯二酸，0.15mol/L氯化钠，0.1%吐温-20，pH7.5)清洗20min，然后用封闭液(blockingbuffer：2%blockingreagent0.1mol/L顺丁烯二酸，0.15mol/L氯化钠，0.1%吐温-20，pH7.5)在室温下清洗1h；置于4000倍稀释的抗地高辛抗体(DIG)中，于4℃冰箱中反应过夜；加入清洗液(0.1mol/LTris-HCl，pH9.50.1mol/L氯化钠，0.05mol/L氯化镁，0.1%吐温-20静置20min，用BMpurpleAP染色，观察基因表达部位、范围与强度等，对特定基因的表达进行定位，并运用CCD摄像系统进行解析。

1.6RNA的提取及定量PCR(QRT-PCR)技术总RNA的提取使用TrizolRNA提取试剂盒。取受精后24h的胚胎，分成3组，即3次重复，每个重复30粒鱼卵，匀浆后，加入氯仿于4℃、12000r/min下离心10min；离心后用移液枪移取上层水相(含有RNA)到新管中，用异丙醇沉淀RNA，经80%乙醇冲洗2遍后用无核酸酶水溶解，采用多功能酶标仪测定OD260和OD28值，并计算OD260/OD280的比值，求出RNA产量转录采用反转录酶2μL、5×Buffer4μL、5mmoL/dNTP4μL、反转录抑制剂1μL、特异下游引物1μL和总RNA1μg，最后加无核酸酶水至20μL于42℃60min→95℃5min→冰水中冷却5min备用。SYBRGreenIQRT-PCR方法的建立：在25μ反应体系中，加入SYBRGreenIPCR反应混合液12.5μL，Vasa上、下游引物各0.5μL，cDNA2μ(1ng)，水9.5μL；于95℃10min→95℃15s→60℃1min，40个循环。内参基因为β-Actin，采用2-ΔΔCT方法计算基因表达的相对变化。

1.7统计方法数据用SPSS统计软件在单因素方差分析方法中进行多重比较。结果以平均值±标准误差表示差异显著性水平设置为P<0.05。

2结果与分析

2.1草铵膦对斑马鱼胚胎及仔鱼的致死作用用草铵膦染毒受精后2h的斑马鱼胚胎，于受精后第120小时取样观察发现，随草铵膦处理浓度升高，各处理间死亡率存在差异。其中对照组、0.001、1.0、1.3、1.6和2μg/L浓度组的死亡率分别为13.3%、10%、10%、13.3%、60%和100%(图1)，且1.6和2.0μg/L处理间存在显著差异，这两组与其他处理间也存在显著差异。

2.2草铵膦对斑马鱼胚胎和仔鱼形态的影响草铵膦可引起斑马鱼胚胎黑色素沉着障碍和仔鱼尾部弯曲(图2)。在受精后2h用草铵膦进行染毒，于受精后120h记录。对照组、0.001、1.0、1.3和1.6μg/L浓度组畸形率分别为0、0、0、70%和40%；2μg/L浓度组全部死亡(图3)。草铵膦可诱导斑马鱼仔鱼尾部弯曲(图4)。用草铵膦染毒受精后2h的斑马鱼胚胎，于受精后120h取样观察发现，对照组、0.001和1.0μg/L浓度组尾部弯曲率均为0；1.3μg/L浓度组尾部弯曲率平均为70%；1.6μg/L浓度组尾部弯曲率平均为23.3%；2.0μg/L浓度组全部死亡(图5)。高浓度草铵膦可阻碍斑马鱼胚胎的黑色素沉着(图2D)。用草铵膦染毒受精后2h的斑马鱼胚胎，于受精后48h取样观察(图6)发现：对照组、0.001和1.0μg/L浓度组无黑色素沉着；1.3μg/L浓度组无黑色素沉着率平均为23.3%；1.6μg/L浓度组无黑色素沉着率平均为40%；2.0μg/L浓度组全部死亡。

2.3草铵膦对斑马鱼Vasa基因表达的影响Vasa基因是斑马鱼原始生殖细胞相关基因，本研究采用1.3μg/L(有畸形但未出现死亡的浓度)和0.001μg/L(微量浓度)，在受精后2h染毒，于受精后24h取样，每个处理取10枚鱼卵固定，进行原位杂交，图7中紫色为Vasa基因。与对照组相比，0.001μg/L低浓度组没有明显的Vasa基因表达被抑制现象(图7)，但1.3μg/L浓度组有明显的Vasa基因表达被抑制现象。进一步应用QRT-PCR进行了定量测定。0、0.001和1.3μg/L3个处理从受精后2h染毒至受精后24h，收集鱼卵提取总RNA转录cDNA，以β-Actin为内参基因，发现经0.001和1.3μg/L草铵膦处理后，在受精后24h可引起Vasa基因表达分别下调1.2和3.8倍(图8)。表明草铵膦具有潜在的生殖毒性。

3结论与讨论

目前，尚未见关于草铵膦对斑马鱼毒性的研究报道。本研究用不同浓度草铵膦染毒受精后2h的斑马鱼胚胎，检测了草铵膦的致死毒性、致畸作用和潜在的生殖毒性，并评价了其毒性作用。结果显示，草铵膦致死浓度范围窄，于受精后2h染毒，当其质量浓度为1.3μg/L时，斑马鱼无死亡，而当其质量浓度升高到2.0μg/L时，斑马鱼全部死亡。另有研究显示，草铵膦能特异性诱发小鼠神经上皮细胞凋亡[18]，并且细胞凋亡发生在小鼠神经上皮细胞中的脑泡细胞和神经管中，而不是间质细胞[19]。还有研究发现，产前和产后的小鼠经低浓度草铵膦暴露会造成神经损伤并诱导自闭症的产生[20]。这些都表明草铵膦对小鼠具有神经毒性。在草铵膦的致畸作用方面尚缺少相关报道，在小鼠试验中没有发现其致畸作用[21]，这与本试验中草铵膦可引起斑马鱼尾部弯曲和抑制黑色素沉着的结果不符，原因可能是由于供试动物和试验方法不同。本试验还发现，尾部弯曲和抑制黑色素沉着不一定同时发生在同一条鱼身上，其中有一部分鱼只出现尾部弯曲现象而黑色素沉积正常，而另外一部分鱼无黑色素沉积但尾部正常。在生殖毒性方面，已明确草铵膦会引起小鼠胚胎着床障碍[21]。本研究中用草铵膦1.3μg/L于受精后2h染毒，24h取样通过原位杂交和QRT-PCR技术，可监测到斑马鱼Vasa基因表达受到抑制，该结论与文献报道相符，从而印证了草铵膦对斑马鱼胚胎具有生殖毒性。

作者：王丰 陈形 杨达汉 杨景峰 康桂英 赵宝全 李小满 蒲韵竹 郑娜 董武 单位：内蒙古民族大学 动物科技学院 军事医学科学院 毒物药物研究所 中国科学院 东北地理与农业生态研究所 中国科学院 近代物理研究所