瘦素受体对苏钟猪脂肪沉积调控的影响范文

本站小编为你精心准备了瘦素受体对苏钟猪脂肪沉积调控的影响参考范文，愿这些范文能点燃您思维的火花，激发您的写作灵感。欢迎深入阅读并收藏。

《南京农业大学学报》2015年第五期

随着生活水平的不断提高，人们对猪肉品质的要求也越来越高。脂肪沉积是影响猪肉品质和营养价值的一个关键因素，因为脂肪沉积可以影响很多重要的肉质性状，如背膘厚、肌内脂肪含量、瘦肉率等。另外，猪作为一个良好的动物模型，在研究人类肥胖候选基因的研究中发挥重要的作用。因此，开展猪的脂肪沉积机制研究具有重大意义。随着定位克隆、物理作图和候选基因等分子生物学技术的发展，研究人员已成功发现许多影响猪脂肪性状的主效基因，如过氧化物酶体增殖物活化受体基因(PPARs)、肥胖易感基因(FTO)、脂蛋白脂肪酶基因(LPL)等。瘦素受体(LEPR)是一种跨膜受体，属于Ⅰ类细胞因子受体家族，由细胞外的配体结合区、跨膜区及胞内区3部分组成。瘦素受体与瘦素(LEP)相互结合发挥着广泛作用，如机体体质量平衡控制。在小鼠上，前人研究发现LEPRmRNA在越来越多的组织上有表达，包括心、肝、肾、肺、小肠、卵巢和脂肪组织等。在猪上，LEPRmRNA在脂肪组织、脑、肌肉、脂肪、肝、下丘脑、垂体和繁殖组织(子宫内膜、卵巢)上均有表达。但是，关于中国高脂肪含量猪和低脂肪含量猪LEPR的表达差异及表达量、编码序列单核苷酸多态(cSNP)与肉质性状关联分析的报道还很少。苏钟猪是以太湖猪为亲本培育的优质瘦肉型猪，肌间和肌内脂肪丰富，本试验通过实时荧光定量PCR方法、免疫印迹和直接测序等技术，从mRNA表达、蛋白表达、cSNP挖掘和性状关联等方面分析了LEPR对脂肪沉积的影响。

1材料与方法

1．1试验动物在江苏洪泽鑫象公司，用背膘仪活体测定背膘厚度大小选取了10头6月龄、(95±3)kg体质量的半同胞健康苏钟猪(高脂猪和低脂猪各半)，这些猪均在同一天被电击昏后屠宰，之后参照屠宰程序［18－19］采集猪的心、肝、肾、眼肌(背最长肌)和背膘等组织样，迅速置于液氮冷冻保存。同时，测定了这些试验猪的脂肪沉积相关性状，包括背最长肌横切面积(求积仪，Haguang)、瘦肉率(SFK，Denmark)、背膘厚(游标卡尺，MNT)等，并根据背膘厚度和试验猪左半边胴体的前躯、中躯和后躯脂肪质量进一步确定了高脂猪和低脂猪(表1)。另外本实验室保存有51头苏钟猪肌肉样或血样，并有这些猪的耳号、出生日期和背最长肌性状(横切面积、pH值、肉色、大理石花纹评分和系水力)等记录，笔者采用高盐法［20］提取这些猪组织样中的基因组，进行LEPR基因的cSNP研究。

1．2引物设计猪LEPR基因的cDNA(GenBank:NM_001024587)全长4050bp，其编码序列为第16～3513bp。LEPR_1引物用于RT-qPCR，LEPR_2引物用于LEPR第18外显子(2726～3464bp)的cSNPs检测。所有引物序列均用Oligo6．0软件设计，由上海英潍捷基(Invitrogen)生物公司合成(表2)。

1．3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)利用Trizol(Invitrogen，USA)/氯仿方法从猪组织样中提取总RNA，以上述提取的总RNA为模板，利用FirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链(Fermentas，Lithuania)，25μL反应体系，试验步骤参考说明书进行。利用实时荧光定量PCR仪(ABISteponeplus，USA)进行PCR扩增。反应体系如下:2×real-timePCRMasterMix(SYBRGreen)10μL，上下游引物(10μmmol•L－1)各1μL，模板(cDNA稀释10倍)1μL，TaqDNAPolymerase0．3μL，加DEPC水到20μL(ABI，USA)。反应条件如下:95℃2min热启动HotStarTaq酶活性;94℃10s，60℃40s，共40循环;45～95℃，读板时按0．1℃•s－1进行熔解曲线分析。内参基因为GAPDH。

1．4Westernblot检测蛋白表达组织样用蛋白裂解液裂解，提取出的总蛋白用BCA蛋白定量试剂盒(Invitrogen，USA)检测。Westernblot过程参照Patel等［23］和付言峰等［24］的方法，一抗用小鼠抗人LEPR抗体(mAb，sc-8391，SantaCruz，USA)，二抗用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(A0216，Beyotime，中国)。利用灰度分析软件(Gel-Pro32)分析电泳条带灰度比值(以GAPDH为内参)。

1．5直接测序法检测cSNPs首先进行LEPR基因目的片段(cDNA第2726～3464bp，位于CDS区)的PCR扩增。反应体系(15μL):7μLPremixTaq(TaKaRa，China)，6μLddH2O，0．5μL各种引物(10pmol•L－1)和1μLDNA。反应条件:94℃5min;94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30循环;72℃7min。利用ABI3730XLDNA测序仪(AppliedBiosystems，USA)对上述PCR产物进行直接测序，每个样品测序2次，即正向和反向各测1次。测序序列和NCBI序列通过DNAMAN5．2进行比对，最终得到LEPR的cSNPs。

1．6数据处理与统计实时荧光定量PCR的数据利用2－ΔΔCT法［25－26］分析，得到LEPRmRNA的相对表达量。用SAS8．2统计软件包的GLM程序进行LEPRmRNA、蛋白表达量、cSNP与脂肪沉积性状之间的关联分析。结果均以最小二乘均值±标准误(LSmeans±SE)表示。

2结果与分析

2．1LEPRmRNA表达对脂肪沉积的影响组织样中提取的总RNA利用分光光度计测定出的A260/A280结果大都处于1．8～2．1的区间，总RNA含量为1．60～2．22μg•μL－1，说明提取的RNA质量较高，可以进行后续的RT-qPCR试验。RT-qPCR结果表明:LEPRmRNA在猪心、肝、肾、眼肌(背最长肌)和背膘中均有表达，且不同组织样中的表达量差异显著(P＜0．05)。其中背膘的表达量最高，且显著高于其他组织(P＜0．05)，其次为背最长肌的表达量，且高脂猪的表达量显著高于低脂猪(P＜0．05)(图1)。由于高脂猪的眼肌(背最长肌)面积和瘦肉率显著低于低脂猪(表1)，即高脂猪的脂肪沉积量显著高于低脂猪，结合文献报道，笔者推测猪脂肪沉积增加，引起LEPRmRNA表达量升高，促进脂肪分解，控制猪只体质量的平衡。

2．2LEPR蛋白表达对脂肪沉积的影响Westernblot结果表明:猪LEPR蛋白(NCBIProtein:NP_001019758)在苏钟猪的心脏、肝脏、肾脏、背最长肌和背膘组织中均有表达，且不同组织间表达量差异显著(P＜0．05)，其中背膘中的表达量最高，显著高于其他组织样，其次为背最长肌，而肾脏中的LEPR蛋白表达量最低(图2)。高脂猪的LEPR蛋白表达量显著高于低脂猪(P＜0．05)(图2)，这与LEPRmRNA的表达结果一致。考虑到高脂猪的背膘厚显著高于低脂猪，背最长肌面积和瘦肉率显著低于低脂猪(P＜0．05)(表1)，即高脂猪的脂肪沉积更高，联系到其蛋白表达情况，笔者分析猪肉脂肪沉积增加(背膘增加)，可能引起LEPR蛋白表达量升高，从而更好发挥LEPR促进脂肪分解、控制体质量平衡的功能。

2．3LEPR的cSNPs挖掘笔者对LEPR基因cDNA序列第2726～3464bp(位于CDS区，覆盖了第18外显子92．65%的序列)进行了直接测序扫描，结果发现3个cSNPs，即c.2856C＞T，c．2935C＞T和c．3155C＞T。3个位点的突变均为C→T的突变。这3个cSNPs中，只有c.2856C＞T位点有3种基因型，呈现多态性，分别为CC、CT和TT基因型(图3)。

2．4LEPR的cSNPs对脂肪沉积的影响LEPR的cSNPs(c.2856C＞T)基因型与脂肪沉积相关肉质性状的关联分析结果表明:对于背最长肌面积/体质量、瘦肉率、pH值和肉色评分，CC基因型显著大于TT基因型(P＜0．05);相反，对于肉色L*值、肉色a*值和大理石花纹评分，CC基因型显著小于TT基因型(P＜0．05)。考虑到背最长肌面积/体质量、瘦肉率和肉色a*值，低脂猪极显著大于高脂猪(P＜0．01)。笔者推测，TT基因型猪关联的肉质性状中，背最长肌肉色更亮、大理石花纹更丰富、瘦肉率和眼肌面积更低，与高脂猪的肉质性状结果类似，即TT基因型更有利于猪的脂肪沉积，T等位基因是脂肪沉积有利等位基因(表3)。

3讨论

脂肪沉积可以影响猪的肉质性状，如背膘厚、背最长肌面积和肌内脂肪含量等，这些肉质性状又进一步影响猪肉的品质，如适口性、香气、嫩度等，直接决定了猪肉的品质和价格，所以猪育种工作者对其越来越重视。关于影响脂肪沉积的基因有肥胖易感基因(FTO)、氟烷基因(halothane)［27］、激酶插入域受体(Kinaseinsertdomainreceptor，KDR)基因等。而本文的瘦素受体(LEPR)基因与瘦素(leptin)相互结合后，在体质量平衡、脂肪沉积过程中发挥着重要的作用。关于其在中国本地猪种不同脂肪含量猪中的研究还鲜有报道，所以本试验开展了LEPR的mRNA和蛋白表达及cSNPs对猪脂肪沉积的影响研究。RT-qPCR结果表明:LEPRmRNA在苏钟猪的心、肝、肾、背最长肌和背膘5种组织中均有表达，且背膘中的表达量显著高于其他组织，这与前人报道的LEPR在其他品种猪的表达结果一致。苏钟猪高脂猪的脂肪沉积高于低脂猪，且高脂猪LEPRmRNA表达量显著高于低脂猪，说明脂肪沉积越高，LEPRmR-NA表达量越高。推测原因可能是脂肪沉积增加引起LEPR表达量增加，从而促进脂肪分解，控制猪只体质量平衡。有研究对波兰5个品种猪分别添加能量饲料后，LEPR在各品种猪肌肉组织的表达量均随着年龄增长而显著升高。

Westernblot结果表明:LEPR蛋白在苏钟猪的心、肝、肾、背最长肌和背膘中均有表达，其中背膘中的表达量最高，且高脂猪的蛋白表达量显著高于低脂猪(P＜0．05)，这与LEPRmRNA表达趋势相同。高脂猪比低脂猪的脂肪含量高、瘦肉率低，而LEPRmRNA和蛋白的表达量都更高，前人对LEPR配体leptin也有类似的研究结果，其发现瘦肉率高的猪leptinmRNA表达量更低，说明瘦肉率与leptin的表达量也成反比。另有报道，LEPR在高肌内脂肪含量猪背最长肌的表达量显著高于低肌内脂肪含量猪。PCR-sequencing和关联分析结果表明，LEPR部分编码序列中检测到3个cSNPs多态位点，其中c.2856C＞T多态位点对瘦肉率、肉色、大理石花纹评分等肉质性状影响显著，T等位基因为脂肪沉积的有利等位基因。这个SNP突变不直接引起氨基酸的改变，但其可以通过与其他SNP的连锁不平衡间接引起氨基酸的改变。有研究表明，LEPR多态性显著关联着杜洛克×长白×大白三元杂交猪的脂肪含量、脂肪分布和脂肪组成，LEPR多态性显著关联韩国本地猪×大白二元杂交猪的系水力、肌内脂肪、胆固醇和风味评分。综上所述，LEPRmRNA和蛋白在苏钟猪的背膘和背最长肌中均有高表达量，且高脂猪的LEPR表达量显著高于低脂猪，可能是脂肪沉积的增加引起LEPR的表达量增加，从而使LEPR更好得发挥其“促进脂肪分解，控制猪只体质量平衡”的作用;LPER多态位点c.2856C＞T中T为脂肪沉积的有利等位基因。上述结果表明LEPR基因对猪的脂肪沉积有一定影响，可以作为苏钟猪肉质改良育种中重要的候选基因。

作者：付言峰 李兰 周艳红 李碧侠 方晓敏 王学敏 任守文 单位：江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省农业种质资源保护与利用平台 中国农业大学动物医学院 国家兽用生物制品工程技术研究中心 南京农业大学动物科技学院