偶氮染料高效降解菌的分析范文

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《农产品加工杂志》2015年第六期

1材料与方法

1.1材料本研究中用于筛选偶氮染料降解菌的环境样品取自辽宁某印染厂附近的土壤中。

1.2偶氮降解菌株的筛选（1）称取采集的环境土样1g，放入装有20mL灭菌蒸馏水的50mL三角瓶中，加入10颗玻璃珠，将三角瓶于震荡摇床上以转速120r/min振荡2h，使灭菌水与土样充分混合，将震荡后的悬浊液静置1h，使颗粒物沉淀，上清液即为供接种的环境样品。（2）取1mL环境样品加入装有50mLLB液体培养基的100mL三角瓶中，于37℃恒温振荡培养12h。采用相同方法接种一代培养菌液1mL至新鲜的LB培养基中进行振荡培养，使样品中的好氧菌群得到富集和活化。（3）分装甲基红筛选培养基50mL于100mL三角瓶中，接种第2次活化菌液1mL进行筛选培养。采用此方法对混合菌液连续筛选培养，观察甲基红的降解效果，初步确定混合菌液中存在能够高效降解甲基红的菌株。（4）将筛选后的混合菌群在固体培养基（甲基红质量浓度为100mg/L）上进行划线分离，且对长出进行的单落划线培养，最终分离出一株能高效降解甲基红的细菌。（5）将筛选出的菌株转接种于LB液体培养基，并向其中加入20%的甘油作为保护剂，于-40℃冰箱中保藏。

1.3降解菌株的鉴定本研究采用16SrDNA序列分析的方法对分离的好氧偶氮降解菌进行鉴定。菌株基因组DNA的提取按本研究组之前所描述的方法进行。以提取的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F：5''''-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3''''；1492R：5''''-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3''''对细菌的16SrDNA序列进行扩增。PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃保温10min，4℃保存。将经纯化后的PCR产物连接至pMD18-T质粒，并转化至大肠杆菌JM109感受态中，挑取阳性克隆子进行序列测定。将拼接后的菌体16SrDNA序列提交至GneBank数据库。并根据测序结果在GenBank数据库中进行同源性比对，下载相关序列，并对序列进行亲缘性及系统发育分析。

1.4菌体生长曲线及染料降解曲线测定（1）将保藏的菌种按接种量2%接种到LB液体培养基中，使菌体活化。（2）将活化后的菌液按接种量2%接种到含有100mg/L甲基红的液体培养基中，于37℃培养箱内培养，每2h取样测菌体于波长600nm处的吸光度（以液体筛选培养基为空白对照）。（3）取2mL菌液离心后于波长490nm处测甲基红的剩余吸光度，以含有100mg/L甲基红的培养基作为空白对照，并计算甲基红降解率。

1.5不同理化因素对菌株降解偶氮染料的影响

1.5.1温度对菌体生长及染料降解的影响将经活化后的菌株H7按2%的接种量接种至降解培养基中（含有100mg/L的甲基红），分别置于20~55℃的环境下培养12h后，取3mL菌液测定其12h后菌株H7的生长量（OD600）及甲基红降解率。

1.5.2pH值对菌体生长及染料降解的影响将经活化后的菌株H7按2%的接种量接种至降解培养基中（含有100mg/L的甲基红），培养基的pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，于37℃好氧培养12h后，取3mL菌液测定菌株H7的OD600及甲基红降解率。

1.6菌株H7对不同偶氮染料的降解在降解培养基中分别加入具有不同结构的偶氮染料（甲基红、橙黄Ⅰ、刚果红、铬黑T、甲基橙、酸性媒介红B），使上述染料在培养基中的质量浓度均达到100mg/L。将经活化后的菌株H7按2%的接种量接种至含有不同染料的降解培养基中，于37℃培养，观察不同染料在培养基中的降解情况。

2结果与分析

2.1偶氮染料降解菌株的初步筛选本研究采用不断在培养基中加入偶氮染料的方法对环境样品中可能存在的降解菌株进行富集，并得到了可以稳定降解偶氮染料的混合菌群。对混合菌群进行划线分离后，选取一株好氧条件下有效降解甲基红的菌株进行研究，并将该菌株标记为H7。菌株H7对甲基红的降解结果见图1。由图1可知，将菌株H7划线于含有100mg/L甲基红的LB固体培养基上，过夜培养后可观察到平板上长有菌体的区域已逐步变为无色直至透明，表明菌株H7可以有效地使甲基红脱色。

2.2降解菌株的分子生物学鉴定本研究扩增了降解菌株的16SrDNA部分序列，以期对该菌株进行分子生物学鉴定。测序结果表明，PCR产物的长度为1504bp。将序列与NCBI数据库比对后，下载相关序列，共同进行系统发育分析。基于各菌株的16SrDNA序列构建的系统树见图2。本研究所筛选出的降解菌株可以与志贺氏菌属（Shigella）菌株聚为一枝，且与肠杆菌科的菌物亲缘关系很近。基于此，笔者认为本研究所分离到的降解菌株属于志贺氏菌属，并将该菌株定名为Shigellasp.H7。目前，很少有报道表明志贺氏菌属菌物有降解偶氮染料的能力。然而，与其亲缘关系相近的肠杆菌科的其他菌物则被证明具有偶氮染料的降解能力。例如，成团肠杆菌（Enterobacteragglomerans）、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）及大肠埃希氏菌（Es－cherichiacol）i等。其中，肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌已被证明可以分别在厌氧、微好氧及好氧的条件下降解偶氮染料。因此，笔者认为肠杆菌科的大部分种属的菌物可能均具有相似的偶氮染料降解能力，今后可重点对肠杆菌科菌物降解偶氮染料的能力进行研究，以明确它们降解染料的机理。另外，肠杆菌科的部分菌株为兼性好氧菌，其在不同氧分条件下均能降解偶氮染料的能力，为其今后的工业化应用提供了有利的条件。

2.3菌株的生长曲线及偶氮染料的降解曲线在本研究中，将菌株H7接入含有质量浓度100mg/L甲基红的LB培养基中，每隔2h分别测定染料的降解率和菌体的生长曲线。菌株H7的生长曲线及偶氮染料的降解曲线见图3。由图3可知，菌株的生长及甲基红的降解是基本同步的。在度过前2h的适应期后，菌株H7在染料培养基中快速生长；12h后菌体的OD600值达到约为1.3，可见100mg/L的甲基红对菌株的生长无抑制作用。在整个生长过程中，菌株H7可快速降解甲基红，结果表明10h内菌株对甲基红的降解率达到90%以上。以上结果表明，菌株H7是一株在好氧条件下对甲基红脱色能力很强的细菌。

2.4温度对菌体生长及偶氮染料降解的影响本研究中测定了在20~55℃内，菌株H7在培养基中的生长情况与对甲基红的脱色情况。温度对菌株H7生长及偶氮染料降解的影响见图4。由图4可知，菌株H7对甲基红的最适脱色温度为40℃，在此温度下约有95%的染料在12h内被降解，且在染料的脱色过程中菌株能够很好地生长。当温度为25~50℃时，菌株H7对甲基红均能进行较为有效的脱色，如在50℃时菌株H7经12h培养后可降解约60%的甲基红。然而，当温度低于25℃或高于50℃时，甲基红的降解速率急剧下降，偶氮染料脱色并不明显。在研究中，温度对偶氮染料的降解影响较为明显。这与之前的研究成果是相一致的。如WongPK等人[15]报道的肺炎克雷伯氏菌株RS-13在温度过高（大于45℃）时即失去了降解偶氮染料的能力。相似的结论在研究大肠杆菌及浅黄色假单胞菌（Pseu－domonasluteola）对偶氮染料的脱色时均有报道[13，17]。高温主要抑止菌株的正常生长及细胞内偶氮还原酶的活性，从而造成染料脱色效率的下降。

2.5pH值对菌体生长及偶氮染料降解的影响研究测定了当降解体系的pH值在4~11时，菌株H7的生长情况与对甲基红的脱色情况。pH值对菌株H7生长和偶氮染料降解的影响见图5。当降解体系的pH值维持在5~10，pH值的变化并未对偶氮染料的脱色造成明显影响，在上述pH值的条件下，经过12h的培养，菌株H7均可维持对甲基红约80%以上的脱色率。菌株H7对甲基红降解的最适pH值为7，在此条件下大于98%的甲基红于12h内被降解。当pH值为4时，菌株H7生长量与染料的脱色率均出现了明显下降，只有不到50%的甲基红在规定时间被降解。然而，菌株H7却可以在碱性条件下对甲基红进行降解，在pH值达到11时，菌株H7可在12h内降解约60%的甲基红。无论在好氧条件还是在厌氧条件下，细菌对偶氮染料降解的最佳条件一般均为近中性。降解体系的pH值过高或过低均对偶氮染料的脱色有负面影响[18-19]。

2.6菌株H7对不同偶氮染料的脱色研究测定了菌株H7在好氧条件下对具有不同化学结构偶氮染料的脱色效果。在脱色培养基中分别加入100mg/L的橙黄Ⅰ、刚果红、铬黑T、酸性媒介红B，以及甲基红、甲基橙后，接种菌株H7后置于震荡培养箱中培养。菌株H7对不同染料的降解能力见图6。由图6可知，菌株H7对各种染料的降解时间和降解率均有所不同。菌株H7可在16h内降解几乎全部的橙黄Ⅰ和甲基红；对酸性媒介红B和刚果红的降解率也分别达到了90%和80%。表明菌株H7对上述4种染料均具有良好的脱色能力。菌株H7对铬黑T也具有一定的脱色能力，16h后约有60%的铬黑T被最终脱色。然而，甲基橙不易被菌株H7所降解，经16h的反应后只有约25%的甲基橙被最终降解。菌株对不同偶氮染料降解的能力和效率的差异性除了取决于菌株的自身特性外，还主要取决于染料自身的化学结构。一般情况下，化学结构较简单的偶氮化合物比较容易降解，如研究中所应用的甲基红和橙黄Ⅰ。另外，偶氮化合物中含有各种取代基，尤其是磺酸基不利于菌株的生物降解[16]。在研究中，菌株H7对铬黑T的降解能力不高，可能是因为其化学结构中含有多个磺酸基的原因。

3结论

本研究在环境样品中分离到一株可以在好氧条件下对偶氮染料进行降解的菌株H7。经分子生物学鉴定后，发现该菌株属于志贺氏菌属的菌株；该菌株可在好氧条件下高效降解甲基红。理化因素对菌株H7的影响显示，该菌株H7可在温度为25~50℃，pH值为5~10及盐度为1%~3%的条件下对甲基红进行有效降解；另外，菌株H7可对多种具有不同化学结构的偶氮染料进行降解。以上的特性为其将来应用于染料废水的工业化脱色创造了良好的条件。

作者：李威崔岱宗林璐瑶邸新李少龙赵敏单位：东北林业大学生命科学学院