植酸酶基因PhyA对陆地棉产量的影响范文

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《棉花学报》2016年第三期

摘要：

在人工控制（培养基、水培、沙培）条件下，植酸酶基因phya具有分解利用培养基质植酸磷、提高磷素利用效率的功能，但在田间的表现目前尚未明确。在前期完成的PhyA转基因陆地棉新材料盆栽试验基础上，将其种植在田间条件下，研究PhyA基因对棉花产量性状的影响。结果表明，部分转基因棉花新材料的单株结铃数、铃重、衣分、籽棉产量、皮棉产量与野生型对照存在显著差异，PhyA在田间条件下具有改良转基因棉花部分产量性状的能力。在此基础上，遴选出2个转PhyA棉花优良新品系G3、G2，可用作今后转植酸酶基因棉花新品种培育的基础材料。

关键词：

植酸酶基因PhyA；田间条件；陆地棉；产量性状；植酸磷

土壤磷有50%～80%以非有效态（如有机态）形式存在，其中一半以上是植酸磷，而植酸磷大多不溶于水，不能被植物直接吸收利用[1-2]。然而，植酸磷可经植酸酶水解后释放出无机磷进而被吸收利用，因而植酸酶基因在分解利用植株根际周围培养基质有机态磷方面具有重要应用[3-6]。有学者发现，如果在无机磷含量较低的培养基质中添加一些能够分泌胞外植酸酶的土壤微生物，或者在这些培养基质中直接添加一些纯化后的植酸酶，能够明显提高植物对根际土壤中植酸磷的利用能力[7-10]。据统计，自Richardson等[11]首次将黑曲霉PhyA转入拟南芥证实植酸酶基因可用于提高培养基质有机态磷利用效率以来，研究者已陆续将黑曲霉、无花果曲霉、烟曲霉、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、苜蓿、大豆中的植酸酶基因转入不同植物，并得到了类似结论[12-22]。目前关于植酸酶基因的多数研究还局限在少数模式植物，且多是在实验室无菌环境下开展的，测定指标也多围绕转基因植株能否分解利用“人为添加或控制”的植酸磷。而关于大田农作物的类似研究，即转基因植株在田间条件下的生长研究却寥寥无几。并且，到目前为止，关于利用植酸酶基因选育出有机磷高效利用植物新品种的成功报道还很少[23]。孔凡利等[24]将枯草芽孢杆菌的植酸酶基因PhyA转入烟草中，在培养基条件下，转基因烟草对植酸磷的吸收利用能力、植株生物量及总磷吸收量显著高于野生型；而在沙培和土培条件下，转基因烟草对植酸磷的吸收利用效率、植株生物量和总磷吸收量与野生型差异不显著。George等[25-27]发现，在控制条件下（如培养基条件），转植酸酶基因的小麦品种表现出较高的有机磷分解利用能力；而在田间条件下，与野生型相比，转基因小麦并未表现出任何显著差异，其分解利用有机磷的能力也未显著提高。由此可见，控制条件和田间条件下的植酸酶基因在发挥功能方面并不完全一致。因此，在克隆、转化植酸酶基因，获得转基因材料，并完成室内试验的基础上，进一步在田间条件下继续深入研究植酸酶基因及其功能，遴选在田间条件下具有分解有机态磷能力的转基因新品系，就成为当前开发利用植酸酶基因、选育有机磷高效利用转基因农作物新品种的重要前提，对于今后解决全球范围内的土壤“遗传学缺磷”问题意义重大。在本课题组前期已将无花果曲霉的植酸酶基因PhyA转入棉花，获得转基因棉花新材料，并已在人工控制条件下完成转基因新材料分解利用培养基质（无菌培养基、Hoagland营养液、蛭石）植酸磷相关研究[28-31]的基础上，本研究进一步分析这些转基因新材料在田间条件下的性状表现，并遴选表现优异的转基因棉花新品系，探讨在田间条件下利用植酸酶基因改良棉花相关性状的可行性，为今后选育分解利用土壤有机磷转基因棉花新品种奠定理论与材料基础。

1材料和方法

1.1供试材料转植酸酶基因PhyA棉花新材料T5。在课题组前期工作中，这些新材料已通过PCR(Poly-merasechainreaction)、Southern杂交、Northern杂交等技术证实目的基因整合在棉花基因组、且能够在RNA水平转录表达，同时在水培和盆栽条件下经过植酸酶活性检测、植株磷含量测定、根际周围植酸磷利用分析等研究，证实该基因在室内控制条件下具有分解利用培养基质植酸磷的功能[29]。其中包括农杆菌介导转化获得的新材料5份（A1、A2、A3、A4、A5），受体品种为农大94-7（CK1），基因枪转化获得的新材料5份（G1、G2、G3、G4、G5），受体品种为农大KB18（CK2）。

1.2研究方法

1.2.1转基因新材料在田间条件下的种植与管理。将转PhyA棉花新材料T5种植在田间条件下（网室内），所选种植地点为连续3年未施用磷肥的土壤。试验采用单因素随机区组设计，3次重复，2行区，行长7m，行距80cm，株距33cm，密度3.75万株•hm－2，管理方法与大田管理条件基本相同。

1.2.2转植酸酶PhyA阳性植株鉴定与筛选。对生长到3至5叶期的转基因棉花新材料T5，利用4000mg•L－1卡那霉素涂抹叶片，7d后观察颜色变化，筛选抗性植株。将抗性植株进行标记，提取基因组DNA，进行植酸酶PhyA的PCR检测。检测引物为F3：5'-GGGCTTCCAGAGCACTAA-3'，R3：5'-ACCAAGACACGGACCAAA-3'，扩增片段长度为750bp；F4：5'-CCAGCACATCCAACAA-CACTCTCG-3'，R4：5'-ATCGTCCAGGCAGATG-AGAACCC-3'，扩增片段长度为600bp。

1.2.3田间产量相关性状测定。以受体材料（野生型，农大94-7、农大KB18）为对照，调查田间条件下转PhyA棉花新材料的株高、第一果枝节位、第一果枝节位高度、单株果枝数、单株结铃数、烂铃数、铃重、衣分、籽棉产量、皮棉产量等性状。性状调查分3个重复，每重复调查10个单株，具体方法参照《国家棉花品种区域试验调查标准》。数据统计分析采用DPS3.01软件。

2结果与分析

2.1卡那霉素筛选与鉴定对T5的卡那霉素涂抹试验发现，野生型对照植株叶片出现黄色褪绿现象；而转基因植株由于带有卡那霉素抗性基因，因而其叶片呈现正常绿色，未出现褪绿现象（图1）。随后，根据T5转基因新材料卡那霉素抗性鉴定结果，筛选出抗性植株进行后续试验。

2.2基因检测与植株入选将入选的卡那霉素抗性植株进行标记，以未转化的受体品种为对照，提取植株基因组DNA，进行植酸酶PhyA的PCR检测。为保证PCR扩增的准确性与可靠性，分别采用2对植酸酶PhyA基因特异引物（F3、R3；F4、R4）进行PCR检测，PCR检测试验独立重复3次，结果（图2）发现，均能够按照预先设计引物扩增出目的条带（F3、R3引物扩增片段长度为750bp，F4、R4引物扩增片段长度为600bp）。同时，为进一步验证PCR扩增结果，回收上述目的条带，经连接pGM-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行菌液PCR，并选取阳性单克隆菌液进行目的条带的DNA测序分析，结果发现，所回收的10个转基因植株样品的目的片段（其中5个样品采用F3与R3引物扩增，另5个样品采用F4与R4引物扩增）测序结果与转入的无花果曲霉的植酸酶PhyA基因序列（GenBankNo.AF537344）完全相同，说明植酸酶基因PhyA确实已稳定地整合至棉花基因组；根据PCR检测结果（图3），筛选出A1―A5、G1―G5转基因株系各30株进行产量相关性状分析。

2.3转基因新材料在田间条件下的产量性状分析分析农大94-7转基因棉花新材料在田间条件下的产量相关性状结果（表1）发现：A4株系的铃重显著高于野生型对照，A2、A1、A3、A5株系的衣分均显著高于野生型对照；而其他产量相关性状，如株高、第一果枝节位高度、第一果枝节位、单株果枝数、单株结铃数、烂铃数、籽棉产量、皮棉产量均未显著超过野生型对照。说明PhyA的转入有利于改良转基因棉花农大94-7株系的铃重与衣分。通过分析农大KB18转基因新材料在田间条件下的产量相关性状（表1）发现：G3株系的单株结铃数和衣分显著高于野生型对照，G5株系的铃重显著高于对照，G3、G2株系的籽棉产量与皮棉产量均显著高于野生型对照；而其他的产量相关性状，如株高、第一果枝节位高度、第一果枝节位、果枝数、烂铃数则与对照的差异未达到显著水平。说明植酸酶PhyA的转入有利于改良转基因棉花农大KB18株系的单株结铃数、铃重、衣分、籽棉与皮棉产量。

2.4转植酸酶基因PhyA棉花优良新品系遴选通过分析10个转基因株系与野生型对照在田间条件下的产量相关性状，遴选出转PhyA棉花优异新品系2个，分别为G3与G2。其中G3株系的衣分、单株结铃数、籽棉与皮棉产量均显著高于野生型对照，分别增加8.26%，24.07%，32.08%，42.95%，在供试株系中表现最优；G2株系的籽棉产量与皮棉产量显著高于野生型对照，分别增加23.95%，27.37%，表现较好。这2个转基因株系可用作转植酸酶基因PhyA棉花新品种培育的基础材料。

3讨论

磷肥易被固定形成有机态，贮存于土壤中，不能被当季植物吸收利用，造成土壤“遗传学缺磷”[32]。如何充分利用土壤中的有机态磷（尤其是植酸磷），减少外部磷肥施入量已成为农作物土壤养分研究的重要课题。目前，有多位学者[11-31]利用酸性磷酸酶、植酸酶基因转入不同植物，探讨利用基因工程手段改良土壤磷素利用效率的可行性。这些研究分别在培养基、水培、蛭石或沙培条件（控制条件）下，通过外源添加植酸磷或有机磷（模拟田间条件），证实了转化基因具有分解培养基质中有机态磷的功能。然而，关于田间条件下的植酸酶基因作用潜力研究报道甚少，且所得结论与控制条件不同[23,33]。分析其原因，可能是由于转基因植株根际周围的田间环境比室内控制条件要复杂得多，具有不可预测和难以控制的特点。在完成室内控制条件下转PhyA基因材料分解利用培养基质（无菌培养基、Hoagland营养液、灭菌蛭石、盆栽）植酸磷相关研究的基础上，本研究进一步分析这些材料在田间条件下的性状表现，并遴选出表现优异的转PhyA基因棉花新品系。通过分析转植酸酶基因棉花新材料在田间条件下的产量性状发现，部分转基因株系的铃重、衣分、单株结铃数、籽棉产量与皮棉产量显著高于野生型对照，而株高、第一果枝节位高、第一果枝节位、单株果枝数则与野生型对照差异不显著，并且不同株系表现不同。在此基础上，遴选出2个表现较好的转基因新品系。另外，受体品种农大94-7在低磷条件下的衣分数值偏低（32.1%），而转入植酸酶基因的农大94-7新材料如A1、A2、A3，其衣分值则可达到37%～38%，基本接近正常，说明转基因新材料由于含植酸酶基因，能够分解利用根际周围的有机态磷，因而受低磷影响较小。进一步分析本研究结果与课题组前期研究报道[28-31]可以发现，PhyA的转入，使得植株在蛭石盆栽与田间条件下的单株结铃数均显著提高，且提高了植株在蛭石盆栽条件下的衣指与20铃皮棉质量以及在田间条件下的衣分、铃重、皮棉产量与籽棉产量。由此可见，转入植酸酶基因PhyA不仅增加了棉株结铃数，而且提高了棉铃中的纤维产量，因而对于培育土壤有机磷高效利用、皮棉产量有所提高的棉花新品系具有重要意义。

4结论

对转植酸酶PhyA棉花材料在田间条件下的产量性状分析发现，农大94-7转基因株系的铃重、衣分显著高于野生型对照，农大KB18转基因株系的单株结铃数、铃重、衣分、籽棉产量、皮棉产量显著高于野生型对照。这说明PhyA在田间条件下具有改良转基因棉花部分产量性状的能力。依据10份转基因新材料产量性状表现，筛选出转基因品系G3与G2，可作为培育磷营养高效利用转基因棉花新品种的基础材料。

作者：柯会锋 王省芬 吴立强 李志坤 张艳 张桂寅 马峙英 单位：河北农业大学 / 教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室