转CaM基因提高棉花抗寒性范文

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《棉花学报》2016年第三期

摘要：

为了获得耐低温棉花新材料，通过花粉管通道法获得了转cam基因棉花，经过分子检测得到了3个转基因株系。同时对得到的转基因株系的T4代（C1、C2、C3）和棉花受体（CK）在低温处理后的相关生理生化指标进行了初步测定。发现在低温（4℃）处理24h后，C1、C2、C3叶片中的丙二醛（MDA）含量明显低于对照，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的活力、可溶性糖的含量明显高于对照，而常温下（23℃）测定值没有明显的差异。表明转CaM基因棉花在低温时能够通过减轻叶片膜脂过氧化程度，提高抗氧化酶活力等反应来缓解低温对棉花叶片的损伤。本研究筛选出了3个具有一定抗寒能力的转基因株系，为下一步选育抗寒新品种奠定了基础，也为其他棉花抗寒转基因技术提供了理论依据。

关键词：

棉花；CaM基因；低温胁迫；生理特性；膜脂过氧化；抗氧化酶；抗寒性

低温伤害是影响北方春播作物生产的重要因素之一。河北省东北部和新疆部分地区棉田经常会受到倒春寒不同程度的影响，不仅影响了棉花的生长发育而且会增加生产成本。因此，研究和创制耐低温的棉花新材料对棉花的生产和发展具有重要意义。植物的耐低温性受多基因控制，并与其生理状态（植株含水量、发育时期、营养状况等）发生交互作用，因而利用传统的遗传改良方法提高植物低温耐性受到较大制约。随着生物技术的发展，利用转基因技术提高植物抗寒性成为新的技术手段。目前，已有许多关于转耐低温基因的研究，如刘荣梅等[1]利用农杆菌介导法将拟南芥转录因子CBF3基因转入烟草，获得有一定抗寒性的烟草植株；Artus等[2]研究了拟南芥中耐低温基因COR15a的表达，吴纯清等[3]将CBF3和COR15a双价基因转入烟草来改善烟草抗寒性。此外，还有研究将昆虫的抗冻蛋白基因Mpafp149转入烟草[4]，CBF4基因转入拟南芥[5]，美洲拟鲽抗冻蛋白基因（afp）导入番茄[6]，CBF1基因转入水稻[7]等。用于棉花抗寒性改良的耐低温基因有betA[8]、Mpafp149[9]、PEBP[10]等。一般认为钙调素（Calmodulin，CaM）是一种在生物中广泛分布，以Ca2+受体形式参与细胞中多种酶及众多钙依赖性生理调节过程，能调节细胞生长、分化等极为重要的多功能蛋白。Ca2+在植物低温胁迫响应中可能主要起2方面的作用：一是通过稳定细胞膜结构，稳定一些重要蛋白质构象，提高某些保护酶的活性以增强植物的抗寒能力，二是Ca2+在植物对各种外界刺激产生特定生理反应中充当胞内信使，诱导抗冻基因的表达从而提高植物的抗冻力[11]。本研究将石斑鱼（Epinepheluscoioides）钙调蛋白基因CaM改造并转化棉花受体，通过筛选阳性植株，初步分析转基因株系在低温处理后主要生理指标的变化，为下一步选育抗寒棉花新品种奠定基础。

1材料和方法

1.1试验材料石斑鱼钙调蛋白基因CaM（GenBank：KC540636），ORF（Openreadingframe）长度为450bp，编码149个氨基酸残基，2个Ca2+活性结合域。棉花受体为常规陆地棉品系08N109。

1.2CaM表达载体构建利用[12-13]对石斑鱼钙调蛋白基因CaM编码蛋白二级、三级结构和配体结合位点预测，在保留功能基团的基础上对其cDNA.列碱基剪切编辑。改造后的cDNA序列委托上海生物工程公司人工合成，并插入pEGM-T克隆载体，用XbaⅠ和SacⅠ酶切，同时与双酶切载体pBI121连接，获得表达载体pBI121-CaM，图1为载体构建流程图。

1.3花粉管导入外源CaM采用碱裂解法提取CaM菌液中的质粒DNA。将纯化后的质粒DNA溶于pH7.6的TE缓冲液中，测得A260/A280为1.95。于2012年7月在棉花自交授粉当天下午16:00左右用50μL微量注射器将10～12μL含目的基因CaM的质粒溶液注入子房中，含CaM的质粒溶液的质量浓度为20ng•μL－1，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，待种子成熟后收集各株棉花的种子，播种得到T0转化株系。将获得的新个体（T0）自交获得T1植株，继续自交可获得转基因植株的T2、T3、T4，用于后续研究。

1.4转基因植株的PCR检测及测序采取各代转化植株顶端新生叶片，用改良的CTAB法提取转化植株T0、T1、T2、T3和对照植株基因组DNA[14]，以含有CaM基因的质粒DNA为阳性对照。以基因组DNA为模板，采取CaM基因的正反引物进行PCR检测。上游引物：5'-ATGGCTGATCAGCTTACAGA-3'；下游引物：5'-TCAAAAGACACGGAATGC-3'。PCR检测配备25μL反应体系：Mix12.5μL，PrimerF1.0μL，PrimerR1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O9.5μL。反应条件为：94℃预变性10min，进入40个循环（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s），72℃延伸10min。扩增产物用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海Invitro-gen公司测序，重复3次，测序结果用DNAMAN软件拼接、比对。

1.5转基因植株的RT-PCR检测通过CTAB-皂土法提取转基因受体材料及T0转基因植株基因组RNA[15]，采用琼脂糖电泳检测其完整性及纯度。将受体植株和初步挑选出的阳性植株的RNA反转录为cDNA，利用特异性引物进行PCR扩增。1.6转基因植株的抗寒能力测定抗寒能力测定是在T4棉花四叶期对对照及阳性植株进行抗寒初步鉴定。将检测结果为阳性的3个植株（C1、C2、C3）自交获得的T4种子与受体植株自交后得到的种子种植在蛭石上培养成为幼苗，选择长势相近的苗进行试验。转基因幼苗四叶期时从23℃的培养室转入10℃缓冲间炼苗14h，然后转入4℃的空间内处理24h，采取各植株同一位置的叶片测定其丙二醛（Malon-dialdehyde，MDA）、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxide，POD）活力等指标，每个株系设置3次重复。指标的测定参照高俊凤[16]的《植物生理学实验指导》中的方法进行。于上述抗寒指标测定取样后，将幼苗移入10℃缓冲间放置14h，之后转入23℃的培养室培养，观察低温处理后幼苗的恢复情况。采用MicrosoftExcel2007绘图及DPS7.05统计分析软件进行数据处理，并对指标差异显著性采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2结果与分析

2.1CaM基因的改造与表达载体

2.1.1CaM基因的改造及预测的蛋白构象。本研究将450bp的石斑鱼钙调蛋白基因CaM改造为282bp，编码93个氨基酸残基，保留了2个Ca2+活性结合域。目的基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列见图2。通过RecognitionEngineV2.0软件预测钙调蛋白三级结构见图3，其具有EF-hand结构域，能够与Ca2+结合来调节多种代谢过程。

2.1.2目的基因的表达。在表达目的基因的植物表达载体中，目的基因由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动，胭脂碱合酶（NOS）终止子终止。标记基因为新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ（图4）。

2.2转CaM基因棉花的分子鉴定

2.2.1PCR检测。为获得能够正常表达CaM基因的转基因棉花，对234株T0单株进行了鉴定。利用CaM基因特异的上下游引物CAMF/CAMR，对T0代单株基因组DNA进行扩增，其中DNA-PCR检测筛选得到15株阳性植株，图5为部分检测结果。

2.2.2RT-PCR检测。提取受体材料和PCR检测初步挑选出的15株阳性植株的RNA，电泳检测无小分子弥散，说明RNA提取过程中没有发生降解；电泳条带无拖尾，点样孔处无亮带，说明提取的RNA中无蛋白质杂质：RNA质量较好，可以作为下一步PCR扩增模板。把上述RNA反转录成cDNA，利用特异性引物进行PCR扩增，去除假阳性株，筛选得到3株在300bp左右处有条带（图6）的阳性植株。可见，该基因在棉花中能够表达；但整体转化率还比较低，仅为1.3%。

2.2.33个转CaM基因阳性株后代的PCR检测和T4代基因回收测序结果。对3个转CaM基因株系各代自交获得的T1、T2、T3植株分别进行PCR检测，将检测到目的基因的植株进行自交，并对T4部分植株在四叶期进行检测，结果显示CaM基因在本代中均存在（图7）。用PCR扩增产物进行测序，测序结果与改造后的CaM基因序列一致，该序列与石斑鱼钙调蛋白基因CaM（GenBank：KC540636）比对，结果为石斑鱼钙调蛋白基因CaM中的一段序列（图8）。

2.3低温（4℃）处理对转基因和受体棉花的生理生化指标的影响

2.3.1植株的耐低温试验。在棉花四叶期对受体及阳性植株进行耐低温能力的初步鉴定，经过处理后，受体植株叶片逐渐萎蔫，而筛选出的含有CaM基因的植株能够恢复正常，表观结果差异显著（图9）。

2.3.2低温处理对棉花叶片中的MDA含量的影响。由图10-A可见：常温23℃下转基因棉花株系（C1、C2、C3）与对照叶片中MDA含量均在40μmol•g－1左右，无明显差异。经过低温处理后，转基因棉花各株系叶片中MDA含量比常温高25%左右，株系间差异不显著（分别为54.58，52.62，49.59μmol•g－1），而对照棉花叶片中MDA含量显著上升为77.04μmol•g－1，比常温下高90%左右，且显著高于转基因株系。

2.3.3低温处理对棉花叶片中SOD、POD活力的影响。由图10-B和图10-C可见：在室温下，对照和各株系的SOD、POD活力没有明显差异；在低温处理后，转基因株系叶片SOD、POD的活力显著高于对照的。

2.3.4低温处理对棉花叶片中可溶性糖含量的影响。陆地棉的品种抗寒能力与其在低温锻炼中可溶性糖的积累有十分密切的关系：可溶性糖积累可增大细胞液的浓度，以抵抗低温对细胞膜造成的损伤。由图10-D可见：低温处理后转基因株系叶片中的可溶性糖的含量明显高于受体植株；而在室温下，转基因株系与受体间的差异不显著。

3讨论与结论

一般认为，0℃以上低温胁迫对冷敏感植物的损伤首先是改变了磷脂双层膜的膜相，尤其是改变了质膜的空间构象和物理状态。膜相的改变可显著抑制细胞膜正常功能的发挥，而构象的改变则强烈影响膜的稳定性，使蛋白质从膜上解离，并发生膜融合[17]。而Ca2+-CaM信使系统是调节植物抗寒性形成的有关生理生化过程的重要信号系统，Ca2+浓度的变化可以影响磷脂酶D的活力，进而进行膜脂代谢的调节[18]。此外，低温能够引起植物代谢过程及大量产物的变化，全面了解调控这些过程的关键基因，将有助于提高植物抗寒性。代谢产物及相关酶的变化能够反映出植物耐低温的程度。在低温胁迫下，MDA会积累造成细胞膜孔隙变大，细胞膜透性上升，电导率变大，电解质外渗，导致细胞膜系统的严重损伤。SOD、POD作为清除植物体内产生的氧自由基的保护酶，对于维护植物尤其是处在低温胁迫中的植物体内活性氧的产生和消除的代谢平衡起到极其重要的作用。在水稻幼苗受到低温胁迫时，过氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在内的抗氧化酶活力增强，植株体内过氧化氢和丙二醛积累减少[19]。杜萍[20]通过对转BvM14-CaM基因的烟草进行低温、高温、高渗、高盐4种逆境胁迫处理，发现外源基因的插入提高了转化植株对4种逆境的耐受力。这表明，CaM基因的表达与植物的抗逆性有关。很多植物在受到逆境胁迫之后，都会产生活性氧从而提高植物体内各种抗氧化酶的活力。

本研究中，所检测棉花植株在受到低温胁迫后，体内产生的SOD、POD等抗氧化酶活力均提高，但转入CaM基因的各株系酶活力上升幅度较大，表明CaM基因可能在一定程度上提高了棉花对低温逆境的耐受性。逆境胁迫会引起植物体内可溶性糖含量的变化。张小芸等[21]研究转冰草果聚糖-1-果糖基转移酶基因（Ac1-FFT）的黑麦草时发现，经干旱处理后，转基因黑麦草体内的可溶性糖含量明显高于未转基因的对照植株，这表明可溶性糖含量的提高可能会增强植物的抗逆能力。范月仙等[22]认为棉花苗期低温处理后可溶性糖的提高可以作为抗冷级别的生化指标之一。本研究中，对棉花植株进行胁迫处理后，转入CaM基因的株系中可溶性糖含量明显上升，且上升幅度都比对照明显，表明CaM基因能够在一定程度上提高棉花的抗低温能力。目前棉花抗寒性研究手段大多采用人工气候室模拟低温条件，虽然可以较好地控制温度来评价低温下棉花的表现，但用这种方法来推断棉花在大田环境中的抗寒性具有很大的局限性，在以后的研究中应更多地结合野外试验来综合评定。此外，转CaM耐低温基因棉花种质尚需深入研究，其生理生化变化及遗传稳定性还需要长期的试验观测，并通过完整的转基因安全评价程序，才能在生产中得到应用。与传统棉花育种方式相比，通过基因工程技术改善棉花的性状相对快捷，但对于转基因棉花中，外源基因能否高效稳定表达以及能否在后代中稳定遗传仍然是转基因棉花面临的难题。外源基因在亲代向子代传递的过程中，不可避免会产生外源基因片段丢失的现象，这导致转基因棉花的应用受到很大的限制。此外，棉花对逆境胁迫的响应是由多种基因协调控制的，单一基因的导入的改良效应可能较小[23]；因此，应通过多个基因联合导入来改善棉花的抗逆性。

作者：赵存鹏 郭宝生 王凯辉 刘素恩 王兆晓 刘冬艳 耿军义 单位：河北省农林科学院棉花研究所 / 农业部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室 /国家棉花改良中心河北分中心