鹅细小病毒酵母双杂交的构建范文

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《经济动物学报》2014年第二期

1材料与方法

1．1质粒、毒株和主要试剂含小鹅瘟病毒SP株VP1基因的pGEX-4T-VP1质粒和大肠杆菌DH5α菌株由吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学实验室保存;质粒pGBKT7、酵母菌Y2HGold、YPDA、SD/-Trp、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His等预混营养缺陷培养基、AureobasidinA和X-α-Gal均购于ClonTech公司;SfiⅠ、BamHⅠ等限制性内切酶、dNTP、ExTaq酶、ExTaqBuffer等均购自TaKaRa公司;质粒小提试剂盒购自O-MEGA公司;DNAGelExtractionKit试剂盒购自AXYGEX公司;酵母质粒提取试剂盒购自TIAN-GEN公司。

1．2引物设计与合成根据GPVSP株的VP2和VP3基因序列设计引物，序列如下。P1/P5和P3/P5分别扩增带有SfiⅠ部分酶切位点的VP2和VP3基因;以第一轮PCR产物为模板，P2/P5和P4/P5分别扩增带有SfiⅠ完全酶切位点的VP2和VP3基因。引物由上海生工生物工程技术公司合成。

1．3VP2和VP3基因扩增以pGEX-4T-VP1质粒为模板，扩增VP2和VP3基因。PCR反应体系:pGEX-4T-VP1质粒2.0μL、10×ExTaqbuffer5.0μL、dNTP(10mmol/L)4.0μL、P1/P5或P3/P5各1μL(10μmol/L)、ExTaq0.5μL，ddH2O补足50μL。反应条件:95℃10min、95℃35s、62℃45s，72℃90s，共30个循环，72℃延伸10min。取1μL第一轮PCR产物为模板，用P2/P5或P4/P5分别扩增含SfiⅠ和BamHⅠ酶切位点的VP2或VP3基因，反应体系和退火温度同第一轮PCR。

1．4pMD-18T-VP2和pMD-18T-VP3重组质粒的构建与鉴定将上述2种第二轮PCR产物分别经10g/L琼脂糖凝胶电泳，并用AXYGEX的DNA回收试剂盒纯化，克隆至pMD-18T载体中，再转化大肠杆菌DH5α感受态。挑取阳性菌落，接种于液体LB培养基振荡培养，参照OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤提取质粒，再用SfiⅠ和BamHⅠ酶分步酶切鉴定，并送往上海生工公司测序。

1．5诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的构建与鉴定将pMD-18T-VP2和pMD-18T-VP3重组质粒分别用SfiⅠ和BamHⅠ内切酶分步酶切后克隆至经上述2种内切酶酶切处理的pGBKT7载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态中。挑取阳性克隆，提取质粒，双酶切确认，最后测序验证。准确无误的质粒可用于转化酵母感受态细胞。

1．6诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3转化酵母菌Y2HGold参照ClonTech公司酵母双杂交试验说明书，以PEG/LiAC法制备酵母菌Y2HGold感受态细胞。分别取pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵质粒5μL和10μL的蛙鱼精子DNA(10mg/mL)混匀，同时以pGBKT7质粒作对照。加入200μLY2HGold酵母感受态中混匀;分别加入600μL灭菌的1.1×PEG/LiAC溶液，振荡混匀，摇床30℃230r/min培养45min;加入80μL的二甲基亚砜后混匀。42℃热激水浴30min，每隔5min振荡1次;1.2万r/min离心5s，弃上清，加入500μL灭菌生理盐水重悬细胞;取100μL重悬菌液涂布于选择培养基SD/-Trp，30℃培养3～8d，待长出白色菌落，挑取数个直径2mm左右的单菌落液体培养，参照TIANGEN酵母质粒提取试剂盒说明书提取质粒，PCR验证。

1．7诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3对报告基因自激活作用的检测将转化有pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空质粒pGBKT7的酵母菌Y2HGold分别接种于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ada/-His、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA和SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA不同营养缺陷型固体培养基中，30℃倒置培养3～6d，观察菌落生长情况，检测VP2和VP3基因对报告基因的自激活作用。

1．8pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3对酵母菌Y2HGold的毒性作用检测从SD/-Trp营养缺陷平板上分别挑取转化成功的pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空载体pG-BKT7的酵母菌Y2HGold单菌落(2mm左右)，接种于SD/-Trp液体培养基中，30℃摇床振荡培养16～20h，测量OD600，以检测VP2和VP3蛋白对酵母菌的毒性作用。若试验组OD600＞0.8，说明诱饵载体无毒性，反之则有毒性。

2结果

2．1VP2和VP3基因的扩增由图1可见，以pGEX-4T-VP1质粒为模板，扩增VP2和VP3基因，大小分别约1800bp和1600bp。

2．2诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的构建及鉴定pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3质粒PCR，扩增出约1800bp(VP2基因)和1600bp(VP3基因)的目的条带;质粒经SfiⅠ和BamHⅠ双酶切，分别得到约7300bp的载体条带和2条对应的目的条带(图2)。测序结果与pGEX-4T-VP1中的VP2和VP3基因碱基序列一致。

2．3pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3转化酵母菌Y2HGold转化诱饵质粒pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp培养基上长出白色菌落。分别随机挑取5个菌落，液体培养，将提取的质粒进行PCR验证，结果分别在1800bp(VP2基因)和1600bp(VP3基因)附近有目的条带(图3)，说明诱饵质粒已成功转化到Y2HGold酵母中。

2．4pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3对报告基因自激活作用检测pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3转化的Y2HGold酵母菌只在SD/-Trp缺陷固体培养基上生长，在其他缺陷培养基上均未见到菌落生长，也无变蓝色现象;其生长特性与空载体pGBKT7转化的酵母菌Y2HGold一致，表明诱饵质粒pG-BKT7-VP2和pGBKT7-VP3在酵母细胞中对报告基因没有自激活作用。

2．5pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3对酵母菌Y2HGold的毒性作用检测含有pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空质粒pGBKT7的酵母菌Y2HGold接种至5mL的SD/-Trp液体培养基中，30℃摇床振荡培养17h，OD600分别为1.763、2.198和2.035;重复2次，其值均大于0.8。说明这2个诱饵蛋白对宿主酵母菌均无毒性作用。

3讨论

病毒感染细胞主要经过吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装与释放等5个步骤，这5个步骤是病毒与细胞蛋白相互作用的结果，阻断其中任何一个步骤均可抑制病毒的繁殖。硫酸乙酰肝素是许多细胞的表面成分，也是多种病毒的受体，但其类似物硫酸葡聚糖及其他聚阴离子物质在低于细胞毒性浓度下能抑制病毒的感染［9-10］。α-葡萄糖苷酶是乙肝病毒的一种细胞结合蛋白，参与乙肝病毒衣壳蛋白糖基化过程，与衣壳蛋白的正确折叠组装有关，抑制α-葡萄糖苷酶的糖基修饰作用，可以在一定程度上抑制乙肝病毒的复制［11］。所以，病毒的细胞结合蛋白可以成为药物靶标，为新型药物的研发提供依据。本试验成功构建了能用于酵母双杂交系统筛选试验的VP2和VP3蛋白诱饵载体，为寻找GPV细胞结合蛋白奠定基础。

作者：徐浩孟繁兴胡桂学董浩张双齐宇李勇勇单位：吉林农业大学动物科学技术学院 吉林农业大学生命科学学院