海洋厌氧氨氧化研究进展范文

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《环境科学与技术杂志》2014年第S1期

1国内外海洋厌氧氨氧化研究进展

1.1海洋厌氧氨氧化细菌研究

1.1.1厌氧氨氧化细菌种类海洋厌氧氨氧化细菌从分类学角度属于浮霉菌纲中比较深的一个分支。尽管不同的Anammox菌的分类学距离较远，但是它们的生理学特性、新陈代谢和细胞结构是相同的[6]。厌氧氨氧化菌为革兰氏阴性球菌，细胞形态不规则，多呈弯月状。Kuypers等在黑海发现了一种新的厌氧氨氧化菌，并定名为Candidatusscalindua，这是首次发现能将自然界中固定的无机氮直接去除的厌氧氨氧化菌[7]。目前为止，学者在自然界发现的厌氧氨氧化细菌共有5种，分别为Candidatusbrocadia、Candidatuskuenenia、Candidatusscalindua、Candidatusanammoxoglobus和Candidatusjettenia，其中只有一属Candidatusscalindua在所有调查的海洋中占统治地位，其他几个属都是在淡水中发现的[8]。而在研究工作中，学者很难在同一个生态系统中找到不同种的厌氧氨氧化细菌，不同的2个厌氧氨氧化菌种之间的分类学距离较远，说明每一种厌氧氨氧化菌占据完全不同的生态位[9]。此外中国近岸海区的厌氧氨氧化研究工作还在起步阶段，中国海调查厌氧氨氧化细菌种类及生态分布将是海洋科技工作者未来重要工作任务。

1.1.2厌氧氨氧化细菌特征目前发现的海洋厌氧氨氧化细菌具有三大特征。（1）细菌细胞壁中缺乏肽聚糖，具有蛋白质的S层，细胞壁上存在漏斗状结构。和所有已知的原核细菌细胞不同，浮霉状菌纲中细菌的细胞结构很独特，包含一个膜包围的亚细胞空间称为厌氧氨氧化体（Anammoxosome），可通过透射电镜得到证实。这是厌氧氨氧化细菌的一种重要结构特征。厌氧氨氧化反应主要在该区域（Anammoxosome）内进行[10]。（2）厌氧氨氧化体膜上具有一种特殊的生物标记———梯形脂（Ladderanelipids），这为鉴别厌氧氨氧化细菌提供了新的判断依据[11]。这种梯形脂的作用是保护细胞可以免受厌氧氨氧化过程中有毒中间产物（N2H4）的毒害。Jaeschke等使用梯形脂作为生物标记物研究了Irish和Celtic海大陆架沉积物中的厌氧氨氧化活动，将出现完整的梯形脂作为检测活体厌氧氨氧化细菌的直接证据，并将死体和活体细菌梯形脂的丰度进行了比较[12]。（3）厌氧氨氧化细菌具有C型细胞色素，经过富集培养厌氧氨氧化细菌表观呈现深红色，在468nm下有强烈吸收。经过我们的实验室研究发现细胞色素C在氨氮和亚硝酸氮不足的情况下会迅速降低，而在重新供给氨氮和亚硝酸氮后细胞色素C又能很快恢复，其细胞色素C缺失和再生机制有待深入的研究。

1.1.3厌氧氨氧化细菌生长厌氧氨氧化细菌生长缓慢，倍增期长达11d，且高细胞浓度时才具有活性，采用常规的微生物学方法难以进行分离鉴定。经过反复试验，Strous发现利用percoll密度梯度离心的方法可以获得99.6%的厌氧氨氧化菌[13]。废水处理厂的厌氧氨氧化细菌生长最适宜的温度为37℃，而海洋厌氧氨氧化细菌最适宜的温度却低得多，比如海底几百上千米深处的温度一般只有几度到十几度，甚至有些永久低温区域温度常年保持在-1℃以下，如Skagerrak海湾年平均温度为4～6℃[14]。我们希望从海洋中富集培养厌氧氨氧化菌，从而可以深入地研究厌氧氨氧化细菌的生长特征。本实验室目前正在从渤海、黄海的沉积物中富集培养海洋厌氧氨氧化细菌。如何加快厌氧氨氧化菌的生长速度，是目前将海洋厌氧氨氧化细菌应用到含盐废水处理工艺中的关键问题，未来通过基因改造缩短生长周期的方法可能解决该问题。

1.1.4厌氧氨氧化机理研究进展1977年，Broda[3]根据热力学反应自由能计算，推测自然界中可能存在2种自养微生物将NH4+氧化成N2。1994年，Mulder等[1]发现荷兰Delft大学一个污水脱氮流化床反应器存在NH4+消失，且随NH4+和NO3-的消耗，有N2生成。随后的实验通过氮平衡和氧化还原平衡证实发生了以NH4+作电子供体、NO3-为电子受体的氧化还原反应。从而证实了Broda的推测。1997年，vandeGraaf等通过15N标记实验发现，厌氧氨氧化是以NO2-而不15N标记实验还显示羟胺和联氨Anammox反应的重要代谢中间产物，而且有少量的NO2-转化为NO3-。羟胺可能来自NO2-，联氨转化为N2的过程被假定为给NO2-还原成羟胺提供电子。由NO2-生成NO3-可能是为了给厌氧氨化菌固定碳提供电子[5]。转化过程中，通过氮平衡计算出NH4+和NO2-的去除，并且产生部分NO3-的比率为NH4+∶NO2-∶NO3-=1∶1.32∶0.26。同位素13C研究表明，Anammox菌利用相同的途径来固定碳，可能是卡尔文循环和乙酰辅酶A途径。

1.2国外海洋厌氧氨氧化研究

自1995年厌氧氨氧化现象被发现之后，各国学者对海洋厌氧海区沉积物中是否存在厌氧氨氧化活动进行了研究。2000年之前有关学者将海洋中氨氮的厌氧氧化过程归因于海底锰氧化物的作用，但后来Thamdrup提出锰氧化物在海洋沉积物中对氨氮的厌氧氧化生成氮气的过程并不重要，同时认为氨氮是富锰海区有机氮的最终矿化产物[15]。直至2002年，Thamdrup等发现在波罗的海过渡区的大陆架沉积物中，24%～67%的N2生成与厌氧氨氧化有关，首次报道了在海洋中存在厌氧氨氧化过程[16]。Dalsgaard等在哥斯达黎加GolfoDulce湾200m深处的缺氧水体中发现了厌氧氨氧化活动，采用15N元素示踪技术定量研究了厌氧氨氧化活动在海洋氮循环过程中的作用，发现由厌氧氨氧化过程产生的N2占到总N2产量的19%～35%[17]。Engstrom等在瑞典、挪威和美国近海沿岸的海洋沉积物中发现了厌氧氨氧化活动，7个站位厌氧氨氧化产生的N2占到总N2产生量的4%～79%[18]，进一步证实了海洋厌氧氨氧化活动在海洋生态系统中的重要作用。此后人们开始了对海洋厌氧氨氧化活动调控机理的研究，Trimmer提出了海洋厌氧氨氧化活动是受沉积物中硝酸氮和亚硝酸氮的双重调控的观点，丰富了海洋厌氧氨氧化作用机理[14]。Woebken发现在Namibian近岸海洋上升流系统中的颗粒物与厌氧氨氧化活动密切相关，并提出了颗粒物与厌氧氨氧化细菌的作用模型[19]。为了进一步研究厌氧氨氧化与反硝化的相互作用，Jensen等研究了海洋沉积物厌氧氨氧化和反硝化的特异性抑制剂乙炔、甲醇和烯丙基硫脲的作用，为海洋沉积物厌氧氨氧化活动与反硝化活动的研究提供了有力的工具[20]。Rich等发现在Chesapeake湾及Choptank和Patuxent两河入海口沉积物的厌氧氨氧化活动具有显著的差异，海湾沉积物厌氧氨氧化活动占15%～20%，而河口的只有0～10%，这证明厌氧氨氧化速率与沉积物中NH4+浓度无关，而是与NO3-浓度和盐度有关[21]。Jensen提出在丹麦的Mariager海湾氮气产生的主要途径是反硝化，厌氧氨氧化受到环境中硫酸盐含量过低或环境波动和厌氧氨氧化细菌本身生长缓慢的影响而减弱[22]。随后人们在大陆架沉积物、河流入海口沉积物、海洋厌氧水体都发现了厌氧氨氧化活动。不仅在欧洲[23]，亚洲的日本[24]、中国[8]及美洲的智利海域[25-26]均发现了厌氧氨氧化活动的存在，但是亚洲海洋的厌氧氨氧化研究还在起步阶段，需要深入细致的研究。我国海洋厌氧氨氧化研究起步较晚，主要集中在海洋沉积物中的厌氧氨氧化生态学研究方面。穆春华等采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）研究了西太平洋深海沉积物微生物多态性，发现在深海沉积物中存在浮霉菌，但未明确是否含有厌氧氨氧化细菌[27]。舒青龙等研究了南中国海沉积物中厌氧氨氧化微生物的多样性，并获得了厌氧氨氧化菌16SrRNA基因序列，证实了我国南海沉积物存在厌氧氨氧化细菌[28]。Strous等利用环境基因组学的手段解密了厌氧氨氧化细菌的进化和新陈代谢过程，将厌氧氨氧化研究推进到了分子水平，为进一步研究海洋厌氧氨氧化细菌的代谢机理提供了很好的技术手段[29]。

1.3海洋厌氧氨氧化的研究方法

海洋水体、沉积物中的厌氧氨氧化活动一般采用15N元素示踪技术进行研究[26]。首先需要先把原水样或沉积物中的O2，有时甚至需要将NO3-、CO2、NO2-去除。然后准备3种不同的标记物，15NH4+，15NH4++14NO3-和15NO3-。经过一段时间培养后，取产生的N2用同位素比例质谱仪分析产生的N2中标记的15N，可以判断是否存在厌氧氨氧化活动。然而，由于新近发现的某些厌氧氨氧化菌具有将硝酸盐或亚硝酸盐异化为氨的能力与反硝化过程效果相同，因此这种方法需要进一步完善才能用于海洋厌氧氨氧化的研究。目前厌氧氨氧化细菌生态学研究还不够深入，需要通过分子生物学、生物信息学等技术手段进行深入研究。现在主要应用于厌氧氨氧化细菌检测的主要分子生物学技术有：16SrRNA-PCR、16SrRNA-PCR-DGGE、16SrRNA-Realtime-PCR、基于16SrRNA和16S-23SrDNA间隔子序列的FISH技术等，这些分子生物学的方法为认识海洋厌氧氨氧化细菌的多样性、分布、进化及定量分析提供了的技术基础[27]。此外，目前研究海洋厌氧氨氧化细菌采用化学生物标志物的方法，即根据厌氧氨氧化体膜上一种特殊结构的梯形脂作为是否存在厌氧氨氧化细菌的依据。该实验结果与同位素标记的实验结果完全一致，说明该方法具有很好的应用前景。但是由于海洋沉积物或水体中厌氧氨氧化细菌丰度极低，分离提取梯形脂存在一定的难度。

1.4厌氧氨氧化的应用研究

1.4.1厌氧氨氧化在海洋氮收支中的作用无机氮（NO3-、NO2-和NH4+）是世界很多海区初级生产力的主要限制因素[20]。海洋沉积物大都处于厌氧状态，沉积物中的亚硝酸盐和硝酸盐一方面发生着反硝化的作用，另一方面氨氮和亚硝酸盐发生着厌氧氨氧化反应。最近的研究表明，造成海洋厌氧区域氮元素全部或大部分损失的原因是氨厌氧氧化（Anammox），而非传统反硝化作用。因为87%的海洋深度超过1000m，全球海洋平均深度为3800m，厌氧氨氧化在这些海区的氮循环中起着重要作用。因此，Dalsgaard认为海洋氮循环中厌氧氨氧化脱氮能占到全球的N2产生量的1/3～2/3[17]。Ward等认为，海洋中30%～50%的N2产出与厌氧氨氧化菌有关[6]。然而，Ward等提出了与先前不一致的观点，认为在阿拉伯海和南太平洋热带海区中主导固氮损失的是反硝化作用，而非氨厌氧氧化，在这一区域，反硝化细菌比厌氧氨氧化细菌更多，即使当厌氧氨氧化速度很显著时也是如此[9]。这项工作解决了我们对全球氮循环和固氮存量的认识中一大不确定性问题，证实反硝化作用是整个海洋氮循环中的一个主要过程。尽管如此，厌氧氨氧化可能只是在个别海区的氮循环中占有一定的比例，厌氧氨氧化和反硝化在产氮中的重要性是由各自底物的减少来调控的。鉴于目前全球还有很多海区未开展厌氧氨氧化的研究，因此还无法对厌氧氨氧化细菌在全球氮循环中的影响作出准确的评估。因此对全球海洋厌氧氨氧化活动的分布，以及在氮循环中的贡献率还有待在更多的海区开展调查研究。

1.4.2海洋厌氧氨氧化菌在废水处理中的应用对于海洋厌氧氨氧化细菌的工程化应用研究还未见报道，本实验室目前正在从事将海洋厌氧氨氧化细菌应用于低C/N比的含盐废水的生物脱氮生物反应器的启动、性能及影响因素的研究，并取得了一定的成果。由于海水具有的天然盐度，这使得众多学者意识到如果将海洋中的厌氧氨氧化细菌在实验室条件下进行富集培养，用于处理低C/N比的含盐废水有很好的市场前景。但是由于海洋中厌氧氨氧化细菌丰度极低，很难进行富集培养。近几年有些学者进行了成功的探索。Nakajima等将无纺布填料放在海底富集厌氧氨氧化细菌3个月，之后将该填料放入柱型反应器中，在实验室条件下经过1a的时间成功启动了海洋的厌氧氨氧化生物反应器[30]。Vossenberg等使用海底表层2cm的沉积物作为接种物，以海盐配置人工海水，经过10个月在实验室成功启动了厌氧氨氧化反应器，富集的厌氧氨氧化细菌纯度达到90%[31]。Takehiko等采用含盐废水污水处理厂的活性污泥，启动了海水性的厌氧氨氧化生物反应器，该厌氧氨氧化反应器用于处理高盐高氨氮地下盐卤水，处理负荷达到了1.6kg（/m3•d）[32]。Yasunori等将海洋废水处理厂沉积物获取的厌氧氨氧化细菌进行富集培养，经过150～250d脱氮效率达到80%，氮负荷达到了0.4kg（/m3•d）[33]。从目前的研究现状来看，以海洋沉积物作为接种污泥启动海水厌氧氨氧化生物反应器过程长，要求条件高，即使启动成功其NH4+和NO2-去除效率也显著低于用活性污泥启动的淡水厌氧氨氧化生物反应器。笔者所在的实验室利用渤海湾海洋沉积物作为接种污泥经过6个月的时间成功启动了含盐废水的海洋厌氧氨氧化生物反应器，目前如何快速启动海洋性厌氧氨氧化生物反应器以及大幅度提高其性能是未来研究的热点。

1.4.3海洋厌氧氨氧化与淡水厌氧氨氧化比较（1）相同点。Anammox细菌在海水淡水环境中都存在，这可能是由于河口是海陆作用最为剧烈、生态结构最为复杂的区域之一，同时也是环境压力最为严重、污染类型最为丰富的区域，致使河口区域环境梯度变化较大，能够营造适合不同种类anammox菌生存的微环境。目前认为，河口环境是anammox菌种群多样性水平最高的区域之一。（2）不同点。一是由于淡水中有机物含量较高，Anammox细菌丰度较海洋沉积物中的要高；二是海洋中的Anammox细菌主要是Scalindua属的Anammox菌占主导地位，淡水中淡水底泥中Brocadia和Kuenenia属的Anammox菌明显占优[34]。

2研究展望

近年来随着对海洋厌氧氨氧化研究的深入，研究的方法和手段取得了很大的进步，但是还存在很多需要解决的问题。目前我们对海洋厌氧氨氧化的了解还是建立在废水处理系统中厌氧氨氧化的研究基础上的。海洋厌氧氨氧化作用机理已取得了初步认识，但海洋厌氧氨氧化具有自身的特殊性，因此不能完全利用水处理领域获得的知识来开展海洋厌氧氨氧化的研究。未来海洋厌氧氨氧化活动研究应就海洋厌氧氨氧化细菌的生态学展开研究，明确其生态条件，进而便于预测全球海洋厌氧氨氧化活动的分布。在东太平洋地区近海大陆架区域由于工农业污水的排放、水产养殖业产生的耗氧有机物使得局部海区出现缺氧，因此这些海区的厌氧氨氧化细菌种群类型、分布特征、主要影响因素的研究亟待加强。因此，未来海洋厌氧氨氧化应加强以下几方面的研究：（1）中国海洋厌氧氨氧化研究起步晚，中国的学者近几年开始了对南中国海沉积物厌氧氨氧化活动的调查研究，而对于中国其它海区如东海、黄海和渤海开展的厌氧氨氧化研究还不多。（2）绘制全球范围海洋厌氧氨氧化活动分布图，以及准确评价海洋厌氧氨氧化在全球海洋氮循环中的重要作用对完善海洋氮的生物地球化学循环具有十分重要的意义。（3）利用海洋厌氧氨氧化细菌的耐盐性，用于低C/N含盐废水的生物脱氮。我国北方黄渤海地区特别是一些海湾地区，存在很多厌氧区域，并且富营养化较为严重，在这样的生态环境中厌氧氨氧化研究具有重要意义。

作者：魏海峰周集体乔森刘远单位：大连理工大学环境学院大连海洋大学海洋科技与环境学院