稀酸预对铜藻生物乙醇的作用范文

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《环境科学研究杂志》2014年第九期

1材料与方法

1.1试验原料试验用铜藻于2012年3月取自浙江省温州南麂海域，将其清洗、烘干和粉碎处理后过80～150目(106～180μm)筛备用．纤维素酶购自江苏淮安百麦绿色生物能源有限公司，酶活约180IU/g．安琪高温酿酒酵母购自安琪酵母股份有限公司．

1.2试验方法

1.2.1铜藻酸水解试验

1.2.1.1单因素试验选取水解温度、液固比、水解时间和w(H2SO4)4个影响因素．称取经洗净、干燥和粉碎后的藻粉2.00g，按照单因素试验条件进行预处理:分别以水解温度(80、90、100、110、120和130℃)进行单因素试验〔固定液固比为15∶1，水解时间为1.00h，w(H2SO4)为3.00%〕;分别以液固比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1)进行单因素试验〔固定水解温度为100℃，水解时间为1.00h，w(H2SO4)为3.00%〕;分别以水解时间(0.50、1.00、1.50、2.00、2.50和3.00h)做单因素试验〔固定水解温度为100℃，液固为15∶1，w(H2SO4)为3.00%〕;分别以w(H2SO4)(0%、1.00%、2.00%、3.00%、5.00%和10.00%)为考察因素进行单因素试验〔固定水解温度为100℃，液固为15∶1，水解时间为1.00h〕．水解完成后抽滤，收集滤液，测定水解液中的ρ(还原糖)．滤渣于80℃下烘干后测定其w(纤维素)和w(半纤维素)．

1.2.1.2响应面试验在单因素试验的基础上，采用Design-Expert进行Box-Behnken试验设计(BBD)．设影响显著的水解温度、水解时间和w(H2SO4)3个因素为自变量，还原糖收率为响应值，根据单因素试验结果设计试验方案，各因素水平值见表1.

1.2.2酶水解及酵母发酵称取经预处理、未经预处理的固体藻粉各2.00g置于250mL锥形瓶中，分别加入100mL蒸馏水，用H2SO4溶液调节至pH为4.8.再分别加入20IU/g的纤维素酶，置于50℃、150r/min摇床内水解1.00h，抽取一定量水解液离心后测定ρ(还原糖)．继续水解2.00h后加入一定量的酵母，并置于摇床内发酵，发酵条件:ρ(酵母)为0.01g/mL，摇床温度为36℃、转速为150r/min，发酵时间5d．反应完成后取出测定ρ(乙醇)．

1.2.3测定方法w(纤维素)和w(半纤维素)分别采用硫酸与重铬酸钾氧化法以及盐酸水解法〔c(盐酸)为2mol/L〕［28］测定;ρ(还原糖)采用DNS法(以葡萄糖作标准曲线)［29］测定;ρ(乙醇)采用重铬酸钾氧化比色法［30］测定．还原糖收率的计算以原料中纤维素和半纤维素可分别水解得到的理论葡萄糖及木糖量为基准。

2结果与讨论

2.1铜藻主要成分用BSA224S天平〔赛多利斯科学仪器(北京)有限公司〕准确称取0.1000g藻粉进行测定，试验重复3次．经测定，铜藻的主要组成:w(纤维素)为37.94%，w(半纤维素)为21.80%，w(木质素)为19.69%．

2.2葡萄糖标准曲线以ρ(葡萄糖)为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线:y=－0.0222+1.6143x，其R2(复相关系数)为0.9974，表明ρ(还原糖)在0～0.5mg/mL范围内，ρ(还原糖)与吸光度有很好的线性关系．采用F检验法对该标准曲线进行显著性检验〔F=9.33，小于F0.01(1，4)=21.20〕，表明x、y线性关系显著．

2.3不同因素对稀硫酸水解铜藻的影响水解温度、液固比、水解时间和w(H2SO4)对稀硫酸水解铜藻的影响见图1.图1(a)为稀酸水解过程中还原糖收率、残渣中w(纤维素)和w(半纤维素)随水解温度的变化．由图1(a)可见，还原糖收率呈先增后减趋势．当水解温度低于90℃时，还原糖收率非常低，不到4.00%．Lee等［31］研究表明，水解反应的活化能高于降解反应的活化能，所以提高水解温度对水解反应更为有利，随之还原糖收率也就越高．因此，当水解温度为90～110℃时，还原糖收率大幅增加，在110℃处达到极大值，约15.00%．当水解温度超过110℃后，还原糖收率与水解温度则呈负相关．这是由于过高的水解温度会加剧葡萄糖、木糖和甘露醇等还原糖脱水，生成糠醛和有机酸等发酵抑制物，影响后续发酵效果．因此，选定110℃作为零水平进行响应面优化．半纤维素分子链中含有游离羟基，并且是由多种单糖聚合而成的非晶体结构．因此，与具有晶体结构的纤维素相比，在酸性介质中半纤维素的糖苷键较易断裂，降解成低聚糖，而低聚糖再进一步水解成单糖．对水解后的残渣进行成分分析发现，在水解温度为80℃时，w(半纤维素)已由原料的21.80%快速降至残渣中的15.03%．水解温度越高，半纤维素水解程度越大;但在其后的升温过程中，下降速率逐渐变缓．这说明在较大的水解温度变化范围内，半纤维素的水解效果变化不大，而残渣中的w(纤维素)在110℃后开始下降，该结论与文献［33］的结论相一致．由图1(b)可见，铜藻的水解还原糖收率随着液固比的增大呈先升后降的趋势．在液固比为20∶1时存在极值，还原糖收率为10.92%．液固比由5∶1增至20∶1时，还原糖收率增加了50.76%，该趋势说明液固比小于20∶1时，提高液固比能增加还原糖收率．原因是液固比较小不足以提供糖苷键断裂所需的H+浓度，并且藻粉与稀酸也不能充分接触．而当液固比大于20∶1时，水解液中会存在过量的H+，导致水解出来的还原糖进一步脱水产生乙酸和糠醛等副产物，造成还原糖收率小幅下降［32］．分析还原糖收率随液固比的变幅可知:在所研究的液固比范围内，还原糖收率的最大值与最小值之差仅为3.68%，说明液固比对水解结果影响不显著．对水解残渣进行成分分析的结果同样支持该结论:残渣中w(纤维素)基本稳定在52.00%～53.00%之间，w(半纤维素)总体维持在6.30%左右．因此，选择20∶1的液固比作为最优参数，不再进行优化试验．由图1(c)可见，水解时间对铜藻水解的影响结果在前2.00h内还原糖收率总体呈上升趋势，于2.00h处达到极值．在短时间的水解过程中，酸溶液中的H+破坏铜藻的糖苷键，使低聚糖和单糖等还原糖得以释放．由此可见，水解时间小于2.00h时，可通过延长水解时间来提高还原糖收率;但大于2.00h时，还原糖收率反而呈下降趋势．文献［34］对H2SO4和HCl水解甜高粱渣产C5和C6等还原糖过程中的发酵抑制物(乙酸、糠醛和羟甲基糠醛等)进行量化分析，结果表明，水解时间和水解温度对抑制物的产生有协同促进作用，抑制物浓度随着时间的增加而增加．研究［35］表明，较高水解温度下，随着水解时间的增加，尽管木质纤维素继续转化为还原糖，但还原糖分解速率大于其生成速率．这意味着水解时间不宜过高，在该试验中不宜超过2.00h．综合这些因素，选取2.00h作为优化参数．水解后残渣中的组分分析结果显示，w(半纤维素)随水解时间的延长而下降．在前1.50h内，w(半纤维素)由21.80%迅速降至5.20%，而后的1.50h内变幅很小，表明延长水解时间对水解效果的影响并不大;残渣中w(纤维素)由原来的37.94%升至1.00h后的53.55%，然后趋于平缓．综上，在水解前期转化的组分几乎全部是半纤维素，而纤维素的水解是在半纤维素和木质素的包被作用被破坏、H+的浓度增加后开始的．由图1(d)可见，w(H2SO4)对还原糖收率的影响非常显著．不加酸时，还原糖收率仅为2.59%．随着w(H2SO4)的增加，水解还原糖收率迅速上升．w(H2SO4)由0增至1.00%时，还原糖收率提高了155.98%．而w(H2SO4)由1.00%增至3.00%、3.00%增至5.00%、5.00%增至10.00%时，还原糖收率提高了30.62%～79.79%，增幅相对较小．w(H2SO4)越高，对设备的腐蚀越强，并且随着w(H2SO4)的增大，还原糖收率的增幅也逐渐减小，因此，w(H2SO4)超过10.00%时不予考察．从化学机理上看，w(H2SO4)较低时为半纤维素的水解提供了适量的H+，H+能完全被半纤维素中糖苷键的断裂所消耗，而当w(H2SO4)达到一定值后，过剩H+会加快还原糖转化成HMF等副产物的速度，从而降低还原糖收率的提升速度．研究［36］表明，采用硫酸水解石花菜制备葡萄糖和乙酰丙酸，在酸水解制备糖的过程中w(H2SO4)不宜过高，否则会导致糖的进一步降解，最适w(H2SO4)为3.00%．综合考虑，选择w(H2SO4)为4.00%进行后期的参数优化．铜藻残渣的成分分析结果显示:当w(H2SO4)由0增至1.00%时，残渣中的w(半纤维素)由13.45%迅速降至6.58%，而后随着w(H2SO4)的逐渐增加，铜藻残渣中w(半纤维素)仅有小幅下降．为验证该结果，将w(H2SO4)由5.00%增至10.00%，w(半纤维素)仅下降5.56%．说明当w(H2SO4)超过1.00%后，w(H2SO4)的增加对半纤维素的水解效果影响不大．而残渣中w(纤维素)的变化趋势显示，与w(H2SO4)为0时相比，w(H2SO4)为1.00%时残渣中的w(纤维素)有较大提高;此后，w(纤维素)呈下降趋势．这可能是因为硫酸使半纤维素糖苷键断裂的同时，也与纤维素中的糖苷键作用，使纤维素发生水解，并且水解速率大于由半纤维素水解引起的w(纤维素)的增长率．

2.4铜藻稀酸水解的响应面试验结合单因素试验结果，以水解时间、水解温度以及w(H2SO4)为自变量，还原糖收率为响应值，根据Box-Behnken设计原理安排了17组试验组合。

2.4.1数据分析以还原糖收率为响应值，采用Design-Expert对铜藻稀酸水解进行多元回归拟合，得到稀酸水解预处理工艺参数初步回归模型:对数据进行统计分析(见表3)可知，在所选择的因素水平范围内〔水解温度为80～130℃，水解时间为0.50～3.00h，w(H2SO4)为0.00%～10.00%〕，w(H2SO4)对还原糖收率具有非常显著的影响(P＜0.0001)，水解温度以及水解时间对其具有显著影响(P＜0.05)，各因素对还原糖收率的影响程度为w(H2SO4)＞水解温度＞水解时间．此外，水解时间的二次项和w(H2SO4)的二次项对还原糖收率影响显著(P＜0.05)，表明还原糖收率与这些因素水平具有非常显著的非线性关系．分析结果还表明，水解温度与水解时间之间具有显著的交互作用(P＜0.05)．基于回归模型方差分析结果，采用Design-Expert作水解时间、水解温度以及w(H2SO4)对还原糖收率影响的响应面和等值线图，结果如图2～4所示．w(H2SO4)为4.00%时，水解温度和水解时间及其交互作用对还原糖收率的影响见图2.响应面显示，水解温度的升高有助于提高还原糖收率;等值线结果显示，水解温度一定时，还原糖收率随时间的延长呈先增加后减小的趋势．原因可能是水解时间过长导致还原糖生成5-HMF(5-羟甲基糠醛)等副产物的速率增加，从而降低了还原糖收率［26］．水解时间为2.00h时，水解温度和w(H2SO4)及其交互作用对还原糖收率的影响见图3.在w(H2SO4)约为3.65%时，随着水解温度由100℃升至115℃，相应的还原糖收率由20.00%增至24.00%;而当w(H2SO4)为5.00%时，水解温度只需105℃即可达到24.00%的还原糖收率．综上可知:在所选择的因素水平范围内，当w(H2SO4)一定时，需要提高水解温度以期增加还原糖收率;同样，当水解温度一定时，较高还原糖收率亦可通过增大w(H2SO4)获得;并且当w(H2SO4)在较高水平时，较低的水解温度也能得到较高的还原糖收率．水解温度为110℃时，水解时间和w(H2SO4)及其交互作用对还原糖收率的影响见图4．等值线接近圆形说明交互作用不显著．响应面结果显示，w(H2SO4)的增加有助于提高还原糖收率，但还原糖收率增加到一定程度后又呈下降趋势．等值线结果显示，在水解时间约为2.15h，w(H2SO4)为4.60%时，还原糖收率存在最大值;当二者水平过低或过高时，均会导致还原糖收率下降．

2.4.2最佳参数的优化与验证基于试验与模型拟合结果，采用Design-Expert对试验参数进一步优化．由软件分析得到最优工艺参数:水解温度为120℃，水解时间为2.07h，w(H2SO4)为4.53%;按该参数条件，还原糖收率预测值为26.21%．为实际操作方便，选取最佳条件:水解温度为120℃，液固比为20∶1，水解时间为2.00h，w(H2SO4)为4.50%．为了检验模型的准确性，在上述条件下进行3次平行试验，还原糖收率平均值为25.57%，与预测值非常接近．因此利用响应面法优化铜藻酸水解预处理参数准确且可行．

2.5酶水解以及酵母发酵结果比较分析将未经预处理的铜藻藻粉进行纤维素酶水解，还原糖收率为5.41%;而对其经过稀酸预处理并进行酶水解后，还原糖收率达44.05%，是未预处理下的的8.14倍．将在最佳预处理条件下处理后的水解液及残渣进行进一步酶水解、发酵，乙醇产率为7.80%，相比于未经预处理直接酶水解及发酵的3.79%有大幅提高．国内外研究者利用大型海藻制备生物乙醇因选用的原料、预处理、酶水解以及发酵等方法的不同，乙醇产率也有所不同(见表4)，利用发酵性能更好的酵母菌株有望得到更好的试验结果;因此，后续工作将在目前利用酿酒酵母的基础上选用能同时利用C5和C6的酵母菌株，以期获得更高的乙醇产率，同时将围绕金属离子对铜藻水解过程的影响展开新的研究．

3结论

a)采用稀酸预处理铜藻可行且有效，可大幅提升酶水解和发酵制醇效果．在所选因素的水平范围内，w(H2SO4)对还原糖收率具有非常显著的影响，水解温度对其具有显著影响，水解时间的影响显著性其次，液固比的影响并不显著．b)通过单因素试验和响应面法对铜藻稀酸水解预处理条件进行优化，确定铜藻稀酸水解预处理的最佳工艺参数:水解温度为120℃，液固比为20∶1，水解时间为2.00h，w(H2SO4)为4.50%．在该条件下，还原糖收率可达25.57%．试验结果表明，稀酸水解铜藻过程中的影响因素之间具有交互作用，并非各自孤立存在．

作者：蒋媛媛包海军曾淦宁艾宁王铁杆张茹霞吴勇单位：浙江工业大学海洋学院浙江工业大学化学工程学院浙江省海洋水产养殖研究所