自然生物膜对罗丹明B的净化范文

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《环境科学研究杂志》2014年第九期

1试验方法

1.1自然生物膜的培养采用以南京玄武湖湖水配置的BG11培养液［17］培养自然生物膜．采用聚氯乙烯材质的弹性立体填料(200mm×0.5mm)作为载体，该材料的添加对水质以及生物膜的生长没有副作用;材料使用前用0.1mol/L的HCl溶液浸泡12h，并使用去离子水反复清洗，以去除杂质．生物膜的培养在盛有30LBG11培养液的透明玻璃容器中进行，容器中添加一定长度的弹性立体填料［18］．培养过程中，在容器口处用空隙尼龙网包扎以防止昆虫以及其他杂物落入．保持水位不变，并定期观察生物膜长势情况．试验期间温度保持在20～38℃之间．

1.2自然生物膜对染料的净化试验试验先进行自然生物膜的扩大培养，即在自然光照的条件下利用BG11培养液于温室下进行静态培养．挂膜2个月左右后，弹性立体填料表面形成致密的深绿色生物膜，生物膜长势成熟，生长旺盛．剪取每段长约20cm且挂有生物膜的弹性材料，置于5L的玻璃容器中，并设立试验组和对照组．其中，试验组中ρ(RhB)为0.5mg/L，对照组不添加RhB，每组设3个重复．试验过程中，每天定时采集水样，用聚醚砜微孔滤膜(孔径0.45μm，滤头直径1.3cm)过滤，采用紫外可见分光光度计(UV2450，岛津公司，日本)测定ρ(RhB)，做好相关记录．采样测试试验共进行11d，当试验组中ρ(RhB)处于较低水平(水质较清澈)后试验结束．

1.3PLFA法测定微生物群落多样性微生物PLFA的提取参照Bligh-Dyer修正方法［19］，以酯化C19∶0为内标，提取、纯化、分析测定流程:取2g干燥生物膜，加20mL氯仿－甲醇－柠檬酸缓冲液(体积比为1∶2∶0.8)直接抽提样品的总脂肪酸，提取的总脂肪酸经硅胶柱(SPE-SI)分离为中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸;其中磷脂酸溶于甲醇－甲苯(体积比为1∶1)溶液，加入10mL0.2mol/LKOH，37℃下酯化15min，用GC-MS(gaschromatograph-massspectrometry，sturn，Varian，美国)分析仪进行不同分子的分离;采用PLFA标准谱图(bacterialfattyacidstandards)和美国商品化的MIDI系统(microbialidentificationsystem)来识别与定量PLFA．

1.4Biolog法测定微生物功能多样性Biolog方法是通过检测样品中微生物对Biolog公司生产的微孔板中的31种不同碳源利用情况来反映微生物群落水平的生理轮廓(communitylevelphysiologicalprofiles，CLPP)，以AWCD(averagewellcolordevelopment，颜色变化率)显示微生物群落对不同碳源代谢的总体情况，其变化速率反映了微生物的代谢活性，最终的AWCD与微生物群落中能利用单一碳源的微生物的数目和种类有关［20］．Biolog法测定微生物功能多样性采用Eco微孔板(BiologHayward，CA，USA)，每块板有96个孔，分为3组，可以同时完成3个重复．每组32个孔，其中第1个孔不含任何碳源，作为对照，其余31个孔各含有1个单独的碳源和四氮唑蓝．具体操作:准确称取相当于5.00g干质量(按含水量换算)的生物膜，置于灭菌的45mL生理盐水(0.85%NaCl)中，室温下180r/min振荡30min后取出，静置5min得到生物膜悬液;在超净工作台中吸取生物膜悬液1mL置于19mL事先灭菌的生理盐水中进行稀释;将稀释后的生物膜悬液接种于Eco微孔板中，每孔150μL，每样1板(为3次重复)，置于25℃暗箱连续培养，分别于24、48、72、96、120、144h在590nm下测定OD值．每个样品的AWCD的计算方法［21］:AWCD=［∑31i=1(Ci－R)］/31式中:Ci为第i个反应孔的OD值;R为对照孔的OD值．另外，主成分分析及碳源利用分析均选用72h的OD值进行计算．

1.5数据统计方法采用MSExcel2007和Origin8.0对数据进行统计和绘图;采用SPSS16.0中的Duncan法和DateReduction程序分别对数据进行差异显著性分析和主成分分析．

2结果与讨论

2.1净化效果由图2可见，自然水体生物膜对RhB染料具有一定的去除效果．随着时间的增加，ρ(RhB)持续降低．在染料添加的第1天，RhB的去除率达到了29.2%，之后几天每d的去除率降至3.9%左右，测试期内总去除率为68.6%．第1天RhB去除率较高的原因可能是吸附在净化过程的开始阶段起到重要作用，吸附过程速率较快［3］．之后几天仍保持一定的RhB去除率可能与生物吸收降解以及光降解有一定关系［22］;但是对照试验证明，该条件下光照对RhB的降解影响较小，总去除率约7.3%，因此，在该试验的采样期间光降解作用可以忽略．WU等［10］对相关的研究报道进行了综述，指出微生物聚集体对污染物质的去除机理主要有吸收、降解和吸附作用．自然生物膜作为一种微生物聚集体，其对RhB的净化机理也可能包含了吸附作用、吸收和降解作用．康春莉等［23］研究证明，自然生物膜中的胞外聚合物的含量占总有机质的80%以上，并且自然生物膜表面存在着大量的阴离子基团(如羧基、羰基等)，这些电负性功能基团对阳离子型污染物质具有静电吸附作用．Solis等［24］综述了近几年真菌、细菌和藻类在染料废水脱色降解中的作用和效果，并指出利用微生物进行染料脱色和降解是经济有效的方法．真菌、细菌和藻类均可以降解部分染料，特别是有些白腐真菌的脱色能力已有了大量的研究结果．Maulin等［25］分离出可以降解偶氮染料的细菌，并发现在pH为6，温度为37℃时该菌对染料的去除率达80%以上．自然生物膜作为一种典型的微生物聚集体，含有大量的真菌、细菌和藻类，其中部分微生物可能对染料具有一定的净化和降解效果;然而环境中的pH、温度、含碳量和含氮量都可能会影响净化效果，从而使得自然生物膜对RhB的去除效果仍处于较低水平．

2.2环境扫描电镜(ESEM)观察采用Quanta200环境扫描电镜对自然生物膜在处理RhB废水前后进行ESEM(environmentalscanningelectronmicroscope，环境扫描电镜)扫描摄像，结果如图3所示．由图3可见，对照组生物膜外表面比较光滑，界限分明，表面大量的丝状物主要为藻类;添加RhB10d后的生物膜边界处较为粗糙，并且呈网状结构，原本界限分明的丝状物出现了增生．究其原因，可能是RhB这种酚类化合物接触了自然生物膜上的微生物，与微生物细胞的蛋白发生化学反应，从而对微生物产生毒性胁迫，诱使其在表面分泌某种物质，进而与RhB结合，或将其隔离于细胞体外来达到自我保护的目的．杨翠云等［26］研究表明，微囊藻毒素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有一定的胁迫作用，细胞通过调节细胞内可溶性蛋白和可溶性糖的含量来抵抗外界胁迫，但随着处理时间的延长，细菌逐渐适应了这种胁迫，恢复正常的生长．李淑英等［27］研究表明，Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+对大薸根际微生物的影响，随微生物区系或生理类群和重金属胁迫浓度的不同而不同，Hg2+对放线菌、细菌、真菌的毒性最强，Pb2+次之．

2.3RhB对自然生物膜微生物群落结构特征的影响PLFA法通过测定微生物膜上的脂肪酸片段结构，分析微生物群落结构和生物量在不同环境中的变化．因为不同类群微生物含有的PLFA种类和数量均不相同，即PLFA和微生物类群数量之间存在着对应的关系，因此该技术常被应用于微生物生态学的研究中，以定量描述土壤、底泥及海水等生境中微生物的群落结构［28-29］．该研究采用PLFA法对微生物生物量以及各菌群进行分析，将试验得到的生物膜微生物磷脂脂肪酸量进行统计分析，可以判断出微生物群落结构多样性．PLFA以“总碳数∶双键数ω双键距离分子末端位置”命名;前缀a和i分别表示支链的反异构和异构，cy表示环丙烷脂肪酸;后缀c表示顺式脂肪酸，t表示反式脂肪酸;10Me表示一个甲基侧链在距分子末端第10个碳原子上．不同PLF段对应的微生物群落如表1［30-31］所示．试验结果见表2。由表2可见，对照组的总PLFA含量大于试验组，说明RhB的添加对生物膜微生物的生物量有一定的影响．RhB的添加使自然生物膜微生物的总PLFA含量减少52.23%，使细菌、真菌和放线菌的数量分别减少了75.81%、67.03%、100%．其中，放线菌几乎消失，这可能是由于放线菌对染料的毒害性更受敏感所致．李淑英等［27］研究发现，微生物对Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+的敏感性表现为放线菌＞细菌＞真菌．但是，自然生物膜中的微生物并未完全被破坏，仍保持一定的数量和种类．为了获得更多可靠信息，不考虑相对含量低于1.0%的单体PLFA，对其余含量较高的PLFA进行主成分分析，提取的前2个主成分的累积贡献率达83.66%，其中PC1(第一主成分)的贡献率为61.06%，PC2(第二主成分)的贡献率为22.60%，分析结果如图4所示．由图4(a)可见，试验组与对照组对于自然生物膜微生物群落PLFA的影响区分较明显，其中，试验组微生物主要表现为与PC2相关的微生物种类，而对照组微生物主要表现为与PC1相关的微生物种类．由图4(b)可见，革兰氏阳性菌的特征脂肪酸(如i15∶0、i17∶0)及放线菌的特征脂肪酸〔如17∶0(10Me)〕在PC1上载荷值较高，说明PC1是它们的代表因子．a16∶0、14∶0是表征革兰氏阳性菌的脂肪酸，在PC2载荷值较高，可以认为PC2是它们的代表因子．综上，RhB对自然生物膜上革兰氏阳性菌和放线菌影响的差异较明显．

2.4微生物群落功能多样性添加RhB不仅影响了自然生物膜上微生物的群落结构和数量，也影响了其活性．由图5(a)可见，在0～24h内，对照组和试验组的微生物群落的AWCD均较低或只有轻微增加;24～48h内2种微生物群落的AWCD随时间表现出几何级数增加;48h至培结束(144h)，2种微生物群落的AWCD随时间的增速趋于缓慢直至达到平衡．无RhB添加的对照组AWCD始终大于试验组，表明接触了RhB的生物膜微生物利用单一碳源的能力减弱了．究其原因，生物膜上的有机质可能与RhB相互作用，降低了其生物有效性［32］．为研究生物膜微生物群落碳源利用多样性的特点，以培养72h的样品为例，对Biolog测试数据进行标准化变换后用于主成分分析，结果见图5(b)．其中，PC1的贡献率为23.59%，PC2的贡献率为18.37%．由图5(b)可见，对照组和试验组表现出了明显的分布差异．Garland等［21］认为，各样本在空间上位置的不同是和碳底物的利用能力相关联的．具体而言，各样本在主成分空间不同轴上的差异是与聚集在该轴上碳源的利用能力相联系的．因此，在RhB的影响下，自然生物膜微生物群落对31种碳源的利用表现出了差异，说明其活性受到了影响．但是这种影响是否对自然生物膜有利尚需进一步判断．另外对与PC1和PC2具有较高相关性的6个碳源进行分析，结果如表3所示．由表3可见，在PC1上载荷较高的6种碳源中，有3种氨基酸、2种碳水化合物、1种多聚物;在PC2上载荷较高的6种碳源中，有3种碳水化合物，羧酸、多聚物和酚酸类各1种，说明影响PC1和PC2的碳源以碳水化合物为主．综上，使自然生物膜微生物群落代谢多样性表现出差异的主要碳源为碳水化合物类，其次为氨基酸类．

3结论

a)自然生物膜对水体中低浓度RhB具有一定的净化作用，其对RhB的去除率，第1天达到29.2%，之后几天每d的去除率降至3.9%左右，在测试期内的总去除率达到68.6%．b)PLFA测定结果表明，RhB的添加使自然生物膜微生物的总PLFA减少52.23%，同时使细菌、真菌和放线菌的数量减少了75.81%、67.03%、100%．通过主成分分析，未添加RhB的自然生物膜与PC2正相关，而添加RhB的自然生物膜与PC1正相关，表明RhB在一定程度上改变了自然生物膜的微生物结构．c)RhB的存在降低了自然水体生物膜微生物群落的AWCD．通过对31种碳源利用的主成分分析结果表明，RhB改变了自然生物膜上微生物群落对31种碳源的利用情况，但是其活性提高还是降低以及是否对自然生物膜有利尚需进一步判断。

作者：周徽冯彦房薛利红何世颖王金花杨林章单位：中国科学院南京土壤研究所江苏省农业科学院农业资源与环境研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室