论猪伪狂犬病病毒检测基因芯片的构建范文

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摘要:为了研制猪伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)诊断DNA芯片，选取PRVgE基因设计引物与探针以构建DNA芯片，同时对基因芯片的探针质量浓度、Poly(dT)的添加、杂交温度、杂交时间进行筛选。结果显示:寡核苷酸探针的浓度在1～30μmol/L之间对杂交信号的影响不大;寡核苷酸探针的氨基化端加上Poly(dT)，49.5℃杂交1h可以获得较好的杂交信号;敏感性试验结果显示，敏感性可达1×10－6ng级，与普通PCR相比高10倍，该芯片具有特异性高、灵敏度高等优点;应用猪伪狂犬病毒检测基因芯片检测20份临床病料，与PCR结果符合率达100%。

关键词:猪伪狂犬病病毒;检测;基因芯片;构建

猪伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种高度接触性传染病，以怀孕母猪流产、产死胎等繁殖障碍和仔猪高死亡率为特征，给养猪业造成了巨大的经济损失［1］。据杨汉春［2］报道，自2011年春季开始，猪伪狂犬病出现暴发流行，众多实验室对分离毒株的基因组序列和致病性以及现有疫苗的交叉保护效果进行了分析，结果均表明流行毒株为变异毒株，且致病性增强，抗原性也发生了一定变异。猪伪狂犬病表现隐性感染、潜伏带毒及病原发生变异成为彻底消灭该病的一大难题，而常规的病因学实验室诊断方法大多耗时、耗力且操作复杂。基因芯片技术是一种新的基因检测技术，与其他技术相比具有更高的特异性和灵敏性，广泛应用于疫病检测中，如SARS病毒、流感病毒及肝炎病毒等的检测芯片都有报道［3－6］。本试验对PRV检测基因芯片的构建条件进行了筛选，在此基础上建立了检测PRV的基因芯片技术，为进一步应用该技术奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株PRVMin－A株及疫苗株以及PRV病料均由河南农业大学猪病门诊提供。

1.1.2主要试剂E．Z．N．ATMTissueDNAKit购自OMEGA公司;10×PCRBuffer，2.5mmol/LdNTP混合物，TaqDNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;杂交缓冲液，DNAMarker500bp购自购自TIANGEN公司;BaioR醛基化载玻片，BaioR点样缓冲液购自北京博奥有限公司;洗液1(2×SSC/0.1%SDS)，洗液2(0.2×SSC/0.1%SDS)，洗液3(0.2×SSC)，洗液4(无菌超纯水)均由本实验室配制，所用试剂均为国产分析纯。

1.1.3仪器设备基因芯片AD1500点样仪，美国Bio－Dot公司;Innoscan700A扫描仪，法国Innop－sys公司;芯片干燥离心机，美国TeleChem公司;梯度PCR扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司;PCR扩增仪，Bi-ometra公司;基因芯片杂交箱，GeneCompanyLimited公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取按照E．Z．N．ATMTissueDNAKit提取试剂盒说明书提取病毒核酸。1.2.2引物与探针的设计与合成根据GenBank中登录的PRVgE基因序列(Gen-Bank序列号为AY170318)，应用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物与探针，上游引物:5'－CTTC-CACTCGCAGCTCTTCT－3'，下游引物:5'－GTAGAT-GCAGGGCTCGTACAC－3'，探针:5'NH2－TTTTTTTTTT－TTACTGCCACGCTGGACTGGTACTACG－3'。下游引物5'端用Cy3进行荧光标记，引物和探针均由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2.3基因芯片的制备用TE缓冲液将合成的探针稀释成100μmol/L的母液，并测定其浓度为1765ng/μL，用基因芯片点样缓冲液稀释成1、5、15、30μmol/L，同时设计基因芯片矩阵阵列，按照各浓度在矩阵上的排列分布情况将各浓度的探针加至96孔U形板中。每张芯片分为6个亚阵列，每个阵列参数为:不同浓度的探针、阳性对照以及阴性对照均为15个重复样点，图1为点样示意图，使用美国Bio－Dot公司的AD1500基因芯片点样仪在醛基化基片上喷点式点样。点样环境参数为相对湿度55%～65%，温度15～30℃，将点样完毕的芯片与盛有探针固定增效剂的敞口容器一同放入密闭容器内，静置于80℃烘箱干燥2h备用。

1.2.4杂交用PCR产物的制备与鉴定按上述方法制备病毒DNA，应用设计的引物进行不对称PCR扩增。反应总体系为25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP3.0μL，10μmol/L的荧光标记下游引物4.0μL，10μmol/L的上游引物1.0μL，DNA模板2.0μL，Taq酶0.25μL，灭菌水12.25μL。反应条件:94℃5min;94℃1min，60℃30s，72℃1min，共30个循环;最后72℃延伸10min。反应结束后取5μL扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳并用凝胶成像分析系统观察拍照。

1.2.5芯片杂交将PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min，立即冰浴10min。取PCR产物与杂交缓冲液以一定比例混合均匀后加至芯片点样区，将芯片放入杂交箱中避光杂交。杂交完毕的芯片分别置于洗液1、洗液2、洗液3以及洗液4中浸泡2min，上下抽提20次洗涤后离心干燥。

1.2.6信号检测与结果分析用Innoscan700A高性能激光共聚焦对芯片进行扫描检测，扫描结果以TIF和JPG格式保存图像。选取每个亚阵的样点信号强度中位值的平均值和信噪比SNP(杂交斑点信号中位值与斑点背景信号中位值之比)对杂交结果进行分析。

1.3芯片制备过程的优化

1.3.1寡核苷酸探针合成时Poly(dT)有无的选择本试验同时合成2条探针:1条氨基化修饰并加有Poly(dT)，1条只经氨基化修饰。芯片点样后分别在相同条件下与同等浓度的PCR产物杂交，选择杂交信号最强的探针。

1.3.2PCR产物与杂交缓冲液比例的选择将PCR产物以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7比例与杂交缓冲液混匀，再与芯片在同样的条件下杂交，根据杂交结果在不影响杂交信号的情况下，选择含有较少PCR产物的比例。

1.3.3杂交湿度的选择芯片分别放入装有灭菌超纯水的杂交盒和干燥的杂交盒内，在同样的条件下杂交，选择最佳杂交条件。

1.3.4探针浓度的选择在大量预试验基础上，将探针分别稀释成1、5、15、30μmol/L样品杂交，选择最佳杂交浓度。

1.3.5杂交时间的选择芯片在相同杂交条件不同杂交时间0、1、2、3、4、5h下杂交，选择信号最强的杂交时间。

1.3.6杂交温度的选择芯片在相同杂交条件不同的杂交温度47.5、49.5、51.5、53.5和55.5℃下杂交，选择信号最强的杂交温度。

1.4敏感性试验用超微量核酸蛋白测定仪测定病毒的DNA浓度，做10倍倍比稀释至1.0×10－7ng/mL，然后以倍比稀释后的模板做不对称PCR扩增，将扩增产物用于基因芯片杂交检测，以检测其灵敏性，同时利用稀释过的模板进行普通PCR的灵敏度验证。

1.5临床样品检测收集20份疑似猪伪狂犬病、表现繁殖障碍症状猪的脑、心、肝脏、脾、肺、肾脏、淋巴结等组织，分别用基因芯片与PCR［7］进行检测，比较其检测结果的吻合度。

2结果与分析

2.1杂交用PCR产物扩增结果分析不对称PCR产物电泳图谱见图2，扩增片段大小为166bp，与预计的目的片段相符。

2.2芯片制备过程优化

2.2.1寡核苷酸探针合成时是否加有Poly(dT)对杂交结果的影响当配基分子量较小时，Poly(dT)可排除空间位阻，促进杂交的顺利进行。本试验选用2条探针，结果表明，加有Poly(dT)的探针的杂交信号明显强于没有加Poly(dT)的探针。

2.2.2PCR产物与杂交缓冲液最佳比例的选择将PCR产物以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7比例与杂交缓冲液混匀，再与芯片在同样的条件下杂交，杂交结果如图4所示。结果表明两者比例1∶1、1∶3时荧光信号强度均较强，而比例为1∶7的荧光信号较弱，在保证荧光信号较强的前提下，我们采用PCR产物与杂交缓冲液1∶3为最佳比例以降低试验成本。

2.2.3杂交湿度的选择置于盛有灭菌水的杂交盒的芯片的杂交信号明显强于干燥杂交盒的芯片。

2.2.4探针浓度的选择将含有1、5、15、30μmol/L的探针芯片与标记样品杂交后。由图可知，不同浓度的寡核苷酸氨基化探针用于杂交后信号强度无明显差别。

2.2.5杂交时间的选择芯片在相同杂交温度，不同杂交时间0、1、2、3、4、5h的条件下进行杂交，杂交信号强度如图7所示。杂交1h的信号强度明显强于0h，但随着杂交时间的延长，其杂交信号反而变弱。

2.2.6杂交温度的选择芯片在相同的杂交时间，不同的杂交温度47.5、49.5、51.5、53.5、55.5℃下杂交信号强度如图8所示，结果表明探针在49.5℃时杂交信号最强。

2.3敏感性试验检测用超微量核算蛋白测定仪测定PRV的核酸浓度为141.9ng/μL，依据琼脂糖凝胶电泳的结果(图9)和基因芯片的杂交结果(图10)可判断，PCR的灵敏度为1×10－5ng/μL，基因芯片检测方法的灵敏度为1×10－6ng/μL。比多重PCR体系检测的灵敏度高出10倍。

2.4临床样品检测利用建立的基因芯片方法对20份临床样品进行检测，然后使用同样的特异性引物进行PCR检测以及阳性样本的PCR产物DNA测序进行验证，结果显示两者结果符合率为100%。

3讨论

基因芯片技术是集分子生物学技术、计算机技术及荧光标记技术于一体的新的基因检测方法，该技术该技术可同时检测多个基因，大大降低假阳性，显著提高信噪比［8］。基因芯片技术在检测疫病时具有高度的敏感性和特异性，并且可检测基因的变化情况。本试验灵敏性检测表明该基因芯片方法的灵敏性比普通PCR高10倍，这与其他参考文献结果一致［7］。当进行大量样本检测时可显示出该检测方法较高的检测率。本试验中的引物和探针设计选用猪伪狂犬病毒的gE基因，gE糖蛋白参与宿主体内的体液免疫应答，宿主一旦被PRV感染后，会迅速产生gE糖蛋白，且持续时间长，选用gE基因作为靶基因，有利于对本病的鉴别诊断。本研究制备检测猪伪狂犬病毒的基因芯片，采用不对称PCR扩增杂交用产物，以获得单链DNA。伍诚意等［9］指出，双链DNA在与探针进行杂交的过程中，除与目的基因杂交外，双链DNA2条链之间还会形成无效的杂交，而单链DNA则避免了这种缺点。且不对称PCR制备的单链DNA的敏感性较高，至少是随机引物法标记的双链DNA的8倍左右［10］。试验结果表明上下游引物采用1∶3的比例可以获得较好的杂交信号。芯片杂交反应是游离的荧光标记靶序列按照碱基互补配对的原则与固定在芯片上的探针结合的过程。但探针与玻片的距离过小会增大杂交时的空间位阻，会使靶序列与探针不易结合。为排除空间位阻作用，本研究在合成探针时，人为的在与芯片结合的一端添加了10个“间隔臂”(Poly(dT))，但间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱［11］。依据刘玲玲［12］试验中不同的探针浓度对芯片杂交信号影响的研究，参考其探针浓度的设置，将本试验中寡核苷酸探针依次稀释成1、5、15、30μmol/L，根据试验中的结果显示，不同的探针浓度对杂交信号的影响不大，为降低试验成本我们选择低浓度的探针用于杂交;杂交时间选择结果显示杂交1h要比杂交0h的荧光信号强，说明杂交时间过短，杂交反应不充分，杂交信号较低，适当的延长杂交时间，有利于杂交反应充分进行，可增强杂交信号。但杂交时间过长，增加了荧光染料在空气中被氧化的几率，降低了杂交信号强度，同时由于杂交时间的延长杂交液的蒸发，会导致特异性杂交中出现部分探针假阳性结果。因此，本试验选择49.5℃杂交1h为最佳杂交条件;在探针末端修饰基团与探针之间加上Poly(dT)可以大大提高杂交效率。该研究建立了单个基因的芯片检测方法，为多基因的检测奠定了基础，更为多病原的联合检测基因芯片的构建奠定了基础。该研究基本达到了试验设计的预期目的，使检测目的性更强，更适合临床检验的需要，有较强的实用性。

作者：吴凤笋1，2；吕玉金2；刘玲玲2；刘胜利3；张中华3；柳增善1 单位：1.吉林大学动物医学学院，2.河南牧业经济学院动物医学院，3.河南农业大学牧医工程学院