红肉柚类胡萝卜素合成酶分析范文

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《果树学报》2016年第四期

摘要：

【目的】对浙江红肉柚类资源进行遗传多样性分析，为其搜集保护和合理利用提供理论依据。【方法】采用RT-PCR技术从11份浙江红肉柚类资源中克隆6个类胡萝卜素合成主链上的关键酶基因片段，分析所得基因片段中的SNP位点，对浙江红肉柚类资源的遗传多样性进行精确研究。【结果】在11份供试材料中克隆到的八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）、番茄红素β环化酶（LBCY）、番茄红素ε环化酶（LECY）和β-胡萝卜素羟化酶（BCH）的基因片段长度分别为348bp、521bp、426bp、429bp、403bp和459bp，其中PSY、ZDS、LBCY、LECY和BCH的基因序列在供试材料中分别有2、12、2、1和1个单核苷酸位点发生变异，多态性频率分别为1SNP/174bp、1SNP/43.3bp、1SNP/213bp、1SNP/403bp和1SNP/459bp，而PDS基因序列在11份供试材料中高度保守，无核苷酸位点变异。利用Mega软件NJ聚类法对6个基因片段的核苷酸序列进行遗传多样性分析显示，11个样品聚为3大类群。官南红柚、文成红心柚、处红柚、木兰柚亲缘关系较近，归于第一类；古磉柚、永嘉红心柚、青田红柚归于第二类；红肉蜜柚、麻步文旦、四季柚和红心四季柚归于第三类。【结论】浙江红肉柚类资源果肉中类胡萝卜素合成主链上的关键酶基因在编码区除PDS均外存在SNP变异，其中ZDS的单核苷酸多态性频率较高，PSY、LBCY、LECY和BCH4个基因片段的SNP变异位点较少，说明类胡萝卜素生物合成基因在柚品种间总体较为保守，但这些变异可能是导致果肉红色深浅程度的变因。根据6个基因片段的核苷酸序列的遗传多样性分析，官南红柚、文成红心柚、处红柚和木兰柚，古磉柚、永嘉红心柚和青田红柚，红肉蜜柚、麻步文旦、四季柚和红心四季柚，分别归于亲缘关系较近的同一类群。

关键词：

柚；红肉；类胡萝卜素；基因片段；SNP分析

柑橘植物中汁胞为红色类型的品种资源较为丰富，如粉红色的红肉葡萄柚（CitrusparadisiiMacf.）、鲜红色的红肉蜜柚（C.gransisL.）、橙红色的红广橘（C.reticulataBlanco）、血红色的血橙（C.sinensisL.）等，这些红肉柑橘品种因色泽鲜艳以及特殊的营养价值而深受消费者欢迎。类胡萝卜素和花青素是红肉柑橘果肉呈色的两类重要天然色素，其中类胡萝卜素是大多数柑橘品种果实成熟时的主要色素，而花青素仅在血橙等少数柑橘品种中积累呈色[1]。迄今已发现的天然类胡萝卜素约800多种[2]，在红肉类型的柑橘品种中，番茄红素和β-胡萝卜素是主要的呈色色素[3]，二者含量的不同使柑橘果肉呈现粉红、鲜红和橙红等颜色上的差异。以琯溪蜜柚的红色芽变品种为例，红绵蜜柚果肉中番茄红素含量较低呈粉红色，红肉蜜柚果肉中番茄红素含量提高20余倍，呈鲜艳的浓红色[4]。在红肉脐橙中当番茄红素和β-胡萝卜素含量均较高时，果肉为橙红色[5]；而在红玉柑等宽皮柑橘中，β-隐黄质的含量高达50%以上，果肉呈深红色[1]。红肉柑橘类型的果肉着色与番茄红素、β-胡萝卜素和β-隐黄质等类胡萝卜素的积累密切相关，这些色素是类胡萝卜素合成途径中重要的中间产物。在类胡萝卜素合成途径中，PSY、PDS、ZDS、LECY、LBCY和BCH是合成主链上的6种关键酶，其中PSY是第一个限速酶，也是决定类胡萝卜素积累总量的核心酶[6]。PSY催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生成无色的八氢番茄红素，然后在PDS和ZDS的连续催化下转化成第一个具有颜色的类胡萝卜素分子—番茄红素。番茄红素在LECY和LBCY作用下生成α-或β-胡萝卜素，然后在BCH作用下转化成β-隐黄质[7]。以上6种酶是参与红肉柑橘果实着色的重要酶，目前在不同柑橘类型中已克隆到这些关键酶基因，成熟柑橘果实中类胡萝卜素的积累是这些基因协同表达的结果[8]。

浙江省拥有多个红肉类型的柚类资源，但果肉颜色的深浅程度差异较大，如四季柚、麻步文旦等果肉颜色为微红色，永嘉红心柚和青田红柚等果肉颜色为粉红色，而古磉柚、官南红柚和处红柚等果肉颜色为鲜艳的浓红色[9]。我们在利用SRAP和SSR分子标记研究浙江柚类种质资源遗传多样性时发现果肉颜色与分子标记聚类结果表现出一定的一致性[10-11]，这促使我们着手研究不同红肉柚类资源果肉着色机理的差异，从而探讨红肉柚类资源的遗传多样性。本研究在11份浙江红肉柚类种质资源中克隆PSY、PDS、ZDS、LBCY、LECY和BCH共6个类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶基因并检测其单核苷酸多态性（SNP），分析类胡萝卜素合成酶基因在供试材料中的遗传多样性，为柑橘类植物进行精确遗传多样性分析奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料果实成熟期采集11份红肉柚类种质资源的果实（表1），分离汁胞组织经液氮速冻处理后放入-30℃低温冰箱中备用。

1.2方法

1.2.1果肉总RNA提取采用Plant/FungiTotalRNAPurificationKit（NorgenBiotek）试剂盒提取果肉总RNA，具体操作按说明书进行，取1.0μg提取总RNA样品进行1%琼脂糖电泳检测。

1.2.2引物设计与合成根据GenBank中登录的柑橘PSY、PDS、ZDS、LBCY、LECY和BCH共6个基因的全长或片段序列设计引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表2）。

1.2.3cDNA克隆及序列分析取1.0μg模板总RNA，加2μLOligo（dT）引物，加DEPC水至20μL，70℃变性10min，迅速放在冰上3min；然后依次加入5×RTbuffer10.0μL，dNTP(10mM)2.0μL，RNaseinhibitor(40U/ul)1.0μL，M-MLV(200U/μL)1.5μL，DEPC水15.5μL，混匀，42℃，1h；70℃，15min，4℃保存。以该cDNA为模板进行PT-PCR扩增。PCR反应体系为50.0μL，10×PCRBuffer5.0μL，2.5mMdNTP5.0μL，Primer(10μM)2.0μL，cDNA5.0μL，rTaq0.5μL，ddH2O32.5μL。所用试剂均来自宝生物工程（大连）有限公司。PCR反应程序为：95℃5min；95℃10s，55℃20s，72℃30s，扩增30个循环；72℃10min。RT-PCR产物经1.5%的琼脂糖电泳后，切下目的片段，回收纯化后送交至英潍捷基（上海）有限公司测序。

1.2.4数据分析采用Seqman7.1.0对测序结果进行剪切和拼接，ClustalX1.83比对序列，MEGA4.0分析碱基序列，邻接法（Neighbor-Joining,NJ）进行聚类。

2结果与分析

2.1基因克隆产物分析果实中因含有大量多糖、多酚等次生物质能与RNA结合，很难从果实中提取大量的RNA[12]。利用Plant/FungiTotalRNAPurificationKit提取的柚果肉总RNA电泳条带清晰、完整性较好，可以作为基因克隆的模板。以反转录合成的样品cDNA为模板，经RT-PCR扩增后6对引物均获得清晰的特异性条带。经克隆测序后，PSY、PDS、ZDS、LBCY、LECY、BCH基因片段长度分别为348bp、521bp、426bp、429bp、403bp和459bp。6个基因片段中，LECY的T碱基含量最高，为31.0%，LBCY的A碱基含量最高，为31.2%，BCH的C、G碱基含量最高，分别为27.2%和23.3%（表3）。

2.2基因片段SNP分析运用ClustalX1.83进行序列比对和SNP分析，找出各基因片段在品种之间的碱基差异。PSY、ZDS、LBCY、LECY和BCH基因序列在11个样品中分别有2、12、2、1和1个单核苷酸位点发生变异，多态性频率分别为1SNP/174bp、1SNP/43.4bp、1SNP/213bp、1SNP/403bp和1SNP/459bp。PSY在第59和169个位点，ZDS在第34、61、69、88、136、152、163、221、235、247、377和383个位点，LBCY在第169和265个位点，LECY在第77个位点，BCH在第284个位点存在单核苷酸变异，PDS基因序列无核苷酸变异位点（表4）。

2.3基因片段的遗传多样性分析运用Mega软件，对所得的6个基因片段序列采用NJ聚类法进行聚类分析。结果显示，11个样品聚为3大类群，第一类包括官南红柚、文成红心柚、处红柚和木兰柚，第二类包括古磉柚、永嘉红心柚和青田红柚，第三类包括红肉蜜柚、麻步文旦、四季柚和红心四季柚（图3）。

3讨论

红肉柚果实不仅色泽具有吸引力，更以含有大量的β-胡萝卜素和番茄红素，具有清除自由基、增强免疫力等功能，而受到市场的欢迎[1]。浙江省作为东南沿海柚区重要组成部分，境内资源丰富，拥有许多红肉类型的柚类资源。苍南县发现果肉鲜红色的古磉柚和粉红色的木兰柚，青田县存在果肉淡红色的青田红柚，丽水农科院从实生柚中选育出果肉鲜红的处红柚[9]。近几年本课题组陆续发现果肉淡红色的红肉四季柚以及文成和永嘉等地的红心土柚[13]。这些特征鲜明的地方红肉柚类品种可作为珍贵的育种资源，但其来源、亲缘关系还尚未明确。本研究从类胡萝卜素合成角度探讨柚类果实的成色机理，克隆类胡萝卜素合成途径中关键酶的基因片段进行SNP分析，研究浙江红肉柚类资源的遗传多样性。SNP是目前最为精确的分子标记技术，其分辨率可达到单碱基变异，可以对亲缘关系较近的材料进行精确的遗传多样性研究[14]。吴波等对柑橘GPAT和SOD基因片段进行SNP分析，分别发现14、18个核苷酸变异位点[15-16]。Savolainen等比较了拟南芥属植物中乙醇脱氢酶基因的单核苷酸多态性，发现8个SNP位点[17]。Germano分析云杉种间SNP，鉴定出3个近缘种间的多态性[18]。Kota等对大麦7个基因型180个EST位点进行SNP研究，发现了72个SNP位点，并利用这些SNP位点进行大麦亲缘关系研究[19]。本试验中，红心四季柚BCH片段第284个位点由A变为C，使得其与四季柚区分，显示出SNP较强的分辨能力。ZDS基因片段发生12个单核苷酸位点发生变异，多态性频率达到1SNP/43.4bp，但其他5个基因片段没有或较少发生变异，这可能与材料为同属植物有关，说明类胡萝卜素生物合成基因在柚品种间较为保守，但这些变异可能是导致果肉红色深浅程度的变因。

作者：林绍生 刘冬峰 陈巍 郭秀珠 徐文荣 黄品湖 单位：浙江省亚热带作物研究所