狂犬病病毒磷蛋白的研究范文

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《广东畜牧兽医科技杂志》2014年第三期

1缺失P基因的狂犬病病毒（def-P）的特性

利用缺失全长P基因的HEP-Flury病毒株的cDNA，通过反向遗传技术构建缺失P基因的狂犬病病毒def-P。使用与缺陷基因有互补功能的细胞系如BHK-P细胞、NA-P细胞拯救病毒，使缺陷病毒增殖和扩增。在将P蛋白作为组成性表达的细胞系中，Def-P病毒能够通过感染该细胞系复制自身基因组和产生子代病毒，但是相对于亲本病毒其生长速率稍有减慢。相反地，def-P病毒感染不表达P蛋白的细胞则不产生子代病毒。试验发现在没有新的P蛋白合成的感染细胞中，def-P病毒可以进行初级RNA转录，但在次级RNA转录和病毒基因组RNA复制时则需要新合成的P蛋白。另外，试验还发现def-P对细胞具有中等毒性，这可能与其减缓生长的现象有关。

2狂犬病病毒P蛋白抑制干扰素信号转录途径

狂犬病病毒能够在产生干扰素的细胞中复制，表明其本身具有某些机制拮抗干扰素的产生。将狂犬病病毒的P蛋白移至启动子的远端或删除后，P蛋白的表达量减少或缺失，狂犬病病毒失去拮抗干扰素产生的能力；P蛋白部分缺失的试验表明，只有编码完整的P蛋白才能抑制β-干扰素的表达。酵母双杂交筛选法证明，STAT1是狂犬病病毒P蛋白的细胞配偶体。P蛋白C末端与STAT1包括DNA结合域及卷曲域的区域相互作用，P蛋白在细胞的表达抑制了α-干扰素和γ干扰素诱导的转录应答。P蛋白通过滞留细胞质中活化的STATs，抑制感染细胞中α/β-干扰素和γ-干扰素刺激的JAK-STAT信号。干扰素刺激应答因子和γ激活序列控制基因的表达，在狂犬病病毒SADL16感染的细胞或共转染质粒表达P蛋白的细胞中被严重破坏。相比之下，表达少量P蛋白的重组狂犬病病毒失去抑制JAK-STAT信号的能力。STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化作用在表达狂犬病病毒P蛋白的细胞中没有被损坏，而是与P蛋白一起沉淀。STAT1局限化与P蛋白局限化有关：在核内表达P蛋白的细胞中，STAT1存在于细胞核内，而在胞质表达P蛋白的细胞中，STAT1也存在于细胞质内。该试验证实P蛋白能阻碍STAT1在细胞核内结合干扰素应答基因启动子的阶段。这便表明STAT1在细胞质的滞留不是参与干扰素抑制的惟一机制。狂犬病病毒P蛋白可通过阻碍干扰素调节因子3（IRF-3）的磷酸化，拮抗α/β-干扰素。将P基因移至启动子下游构建的狂犬病病毒SAD△PLP，可引起S386位的磷酸化、二聚化和IRF-3的转录活性。由转染质粒表达的TBK1的IRF-3的磷酸化在野毒型狂犬病病毒感染的细胞或共转染P蛋白质粒细胞中被消除。说明P蛋白激活IRF-3的上游激酶是必须的，能有效抑制干扰素应答。

3P蛋白与细胞质动力蛋白轻链（LC8）的相互作用

P蛋白是一个多功能性的蛋白。用P基因（CVS株）与神经生长因子诱导的PC12细胞（鼠肾上腺嗜铬神经瘤细胞）cDNA文库进行酵母双杂交试验，探究P蛋白与细胞胞浆内的动力蛋白轻链LC8（dyneinlightchain）的相互作用。结果表明，能在病毒粒子中检测到LC8；P蛋白缺失分析表明LC8与138-172位之间的氨基酸残基相结合，表明LC8与狂犬病病毒在轴突中的运输有关。在另外一组独立试验中，用狂犬病病毒基因I型（PV株）和基因III型（Mokolavirus）的P基因与人脑cDNA文库进行酵母双杂交试验也观察到P蛋白与LC8相互作用。P蛋白144-149位序列（（N/S）KXTQT）高度保守，可能是与LC8结合的位点。将与LC8结合的P蛋白保守序列缺失后的重组病毒与亲本病毒对乳鼠的致病性试验，表明LC8不是狂犬病病毒从外周进入中枢神经系统所必须的。LC8曾被认为是连接病毒核蛋白到宿主细胞运输系统的分子因素，最近的结构研究对该模型提出质疑。构建携带和删除LC8结合域（LC8-BD）的重组狂犬病病毒，试验表明LC8的删除并没有抑制其侵入中枢神经系统，但可显著减弱病毒在中枢神经系统的转录和复制。在RAG2基因敲除小鼠中，证实删除LC8结合域的重组病毒致弱，说明LC8结合域使初级转录减弱，但不会影响狂犬病病毒逆轴突运输过程，而是通过在神经中削弱早期转录和复制以损伤病毒粒子的感染性。

4Def-P病毒的致病性和免疫原性

HEP-Flury毒株是狂犬病病毒中一种最致弱的毒株，可对乳鼠致死，而成鼠即便是颅内接种也不致死。除了表达P蛋白的细胞，def-P病毒对敏感细胞感染率与亲本HEP-Flury毒株相同，在其他细胞上则没有显著的感染。一组试验证明，成鼠接种HEP病毒后体重有波动，而接种def-P则没有；乳鼠以2×103FFU颅内接种rHEP引起100%死亡，相反，即使以2×104颅内接种def-P病毒并不引起乳鼠死亡和任何临床症状。def-P病毒在乳鼠颅内接种后完全不致病的这种特性，是因为def-P能在表达P蛋白的细胞中复制，而在正常的不表达P蛋白的细胞中不能有效复制。用def-P病毒免疫小鼠后可诱导高水平的病毒中和抗体（VNA），而且对所接种小鼠能提供攻毒后的保护力。def-P诱导强大的保护性免疫抵抗狂犬病病毒，几乎不产生子代病毒和严重的宿主损伤。

5近年我国狂犬病病毒P基因的分子遗传特征

通过对两株不同疫苗株和两株分离自宁夏的野毒分析，P基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为83.6%～99.8%和87.2%～99%，P蛋白与胞浆动力蛋白轻链LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸残基，均为DKSTQT，4株病毒P基因作用位点序列显示未发生影响其生物学功能的变异。而对4株湖南狂犬病病毒P基因与I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸相似性比较,P基因分别为78.4%～90.2%和81.8%～86.8%；核苷酸序列及推导的氨基酸序列表明湖南株与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚地区的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。

6小结

分子生物学和反向遗传学技术的发展，使人们对狂犬病病毒的研究越来越深入。对病毒分子结构、复制周期、致病性和免疫原性方面的研究，为全面认识狂犬病病毒的结构和功能的关系提供理论基础和试验支持。对狂犬病病毒P基因的研究，揭示其在整个病毒粒子中的功能和病毒与宿主之间发挥的作用。通过反向遗传学技术构建的def-P病毒，为将来可研制出高效、安全、廉价且使用方便的狂犬病减毒活疫苗提供了候选疫苗株。

作者：郑韶结施赫赫单位：佛冈县高岗镇农业技术综合服务站广东省医学实验动物中心