细胞存活及生长检测方法浅谈范文

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《广东微量元素科学杂志》2016年第11期

摘要:

MTT是一种检测细胞存活和生长的方法。该技术现已广泛用于生物和医学等领域。基于此，针对该法进行探讨，以期与同行探讨，更好地推动生物医学的发展。

关键词:

MTT法;细胞;检测

MTT是一种粉末状化学试剂，化学名为3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。其用途主要有两方面，包括药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养细胞毒性的测定以及细胞增殖和细胞活性测定。该法在生物、医药等研究中具有重要作用［1－2］，鉴于此，以下针对该法进行深入探讨。

1检测原理

活性细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死亡细胞则无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，使用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的数量值与细胞数成正比。根据测得的吸光度值，来判断活性细胞数量，吸光度值越大，表明细胞活性越强。若是测药物毒性，则表示药物毒性越小。2药品和仪器MTT配成的终质量浓度为5mg/mL，须用PBS或生理盐水做溶剂。在配制和保存的过程中，容器应采用铝箔纸包住，确保其无菌。MTT甲瓒溶解液，二甲基亚砜和三联溶解液。酶标仪、分光光度计、倒置显微镜。

2实验方法

2.1细胞计数

使用胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度。细胞密度在长到80%至90%，消化离心收集后，将上清液去掉，加入3mL培养基并混匀。取另一支新的15mL无菌离心管，装入培养基。从第一步准备的3mL细胞悬液中取出1mL，加入上管混匀后进行细胞计数，该浓度相当于细胞计数板4个大格内，其中每大格平均5～10个细胞;如果该浓度不够，应再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50μL计算。细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个，细胞毒性实验每孔5000～10000个。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢等因素来决定细胞数量。

2.296孔平底板铺细胞

制备好细胞悬液后，轻轻混匀，每孔加入100μL，确保待测细胞的密度为5000～10000/孔，用无菌PBS填充边缘孔。因为细胞在混匀后仍要继续沉降，所以接种的过程中要反复多次混匀，例如每加6个孔时就应混匀一次，用以确保各孔间接种的细胞密度完全相同，进而保证MTT结果的准确性。

2.3药物处理

在培养箱中培养已接种好的细胞培养板，在孔板底部铺满单层细胞时(96孔平底板)，加入不同浓度梯度的药物。细胞贴壁后即可加药，时间为2h即可。

2.4观察

药效于培养箱中5%CO2，37℃孵育16～48h后，在倒置显微镜下观察药物的作用效果。

2.5MTT反应

在每孔中加入10μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，继续培养4h。如果药物与MTT能够反应，可在离心后弃去培养液，之后小心用PBS冲2至3遍后，再加入含MTT的培养液。

2.6溶解结晶

终止培养，准备溶解结晶。溶解结晶的方法有两种，一种方法是使用二甲基亚砜溶解。在MTT加入培养4h后，可充分形成结晶。去掉上清液，注意不能把蓝紫色结晶甲瓒移走。每孔中加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm波长处检测各孔的吸光值。另一种方法是使用三联溶解液，在MTT加入培养4h后，可充分形成结晶。直接在每孔中加入100μL溶解液。因为该溶解液含有SDS，在低温保存时易产生结晶，所以在使用之前必须提前几小时置于室温中，待SDS结晶全部溶解后方可使用。放入培养箱中继续孵育4～6h，于镜下观察，待结晶全部溶解后于570nm波长处测定其吸光度值。

2.7吸光度测定

应同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，测定各孔吸光度值。

3结果统计方法

采用改良寇式法计算IC50。

4总结

检测细胞生长、存活和增值的方法有很多种，如BrdU标记法、结晶紫法、酸性磷酸酶法等。每种方法各有其优缺点，而本研究针对MTT检测细胞存活和生长的方法进行了深入探讨。正确掌握该法并将其应用于医药研究和生物医学研究中［3－4］，可以更好地进行科学研究工作，为生物和医学等领域的发展提供可靠的基础数据。

作者:张哲 单位:牡丹江医学院医药研究中心