白蜡多年菌液体培养产胞外多糖条件范文

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《广东农业科学杂志》2015年第二十期

白蜡多年菌（Perenniporiafraxinea）是一种多孔菌科多年菌属的珍稀食药用真菌。野生白蜡多年菌在北京、安徽、湖南、广东等地均有发现，多长于腐朽的树上［1］。作为野生食药用菌，它富含糖类活性物质，并具有较高的营养价值［2］。目前，国内外对白蜡多年菌进行的研究主要在其菌丝纤溶蛋白酶的分离纯化及表征方面［3］，但关于白蜡多年菌液体培养条件的相关研究尚不多见。为此，本试验研究白蜡多年菌液体培养的碳氮源及培养条件对其胞外多糖含量的影响，以期为白蜡多年菌的开发利用及其多糖的工业化生产提供建论依据。

1材料与方法

1.1试验材料供试菌株：白蜡多年菌（Perenniporiafraxinea）菌株，由华南师范大学生命科学学院提供。主要仪器与设备：2-16K通用台式离心机（美国Sigma公司），UV2450紫外-可见分光光度仪（日本岛津公司），pH计（北京时代新维测控设备有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1单因素及正交试验以胞外多糖含量为指标，考察碳源（葡萄糖、麦芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉，浓度分别为25、30、35、40、45g/L）、氮源〔NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素、KNO3、L-谷氨酰胺，氮原子含量为50mmol/L，浓度分别为0.5、1、2、4、8g/L〕、培养液初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、装液量（50、75、100、125、150mL/250mL）、温度（18、21、24、27、30℃）、摇床转速（120、150、180、210、240r/min）及培养时间（5、7、9、11、13d）对菌丝产胞外多糖的影响。在单因素试验的基础上，以正交试验考察温度、初始pH、装液量、培养时间对白蜡多年菌液体培养产胞外多糖的影响，正交试验设计见表1。上述各处理组试验步骤为：将菌株转接于母种培养基的培养皿内，制成平板菌种，用同一打孔器在平板菌种的同一半径上打孔，将4个菌栓接入试验培养基，置于摇床振荡培养。

1.2.2指标测定将发酵液于8000r/min离心5min，弃沉淀，取上清液备用。总糖含量使用苯酚-硫酸法测定［4］；还原糖含量用二硝基水杨酸（DNS）法测定［5］；胞外多糖含量是总糖含量与还原糖含量之差［6］。试验数据用SPSS13.0处理系统进行统计，采用LSD法（最小显著性差异法）进行数据间的方差分析［7］。

2结果与分析

2.1碳源对菌丝产胞外多糖的影响从图1可以看出，白蜡多年菌菌丝在5种不同碳源的液体培养基上都可产胞外多糖，但是其胞外多糖含量存在差异。以蔗糖作为碳源时，胞外多糖含量最高、达到47.56g/L，极显著高于其他碳源。因此，白蜡多年菌菌丝产胞外多糖适宜碳源是蔗糖，这与前人对桦褐孔菌、灵芝等最适碳源的研究结果一致。由图2可知，菌丝在蔗糖浓度25~45g/L范围内均可产生胞外多糖，但其含量有一定差异。随着蔗糖浓度的增高，胞外多糖含量逐渐升高，当蔗糖浓度为40g/L时，胞外多糖含量最高、为57.28g/L，极显著高于其他浓度的胞外多糖含量。当蔗糖浓度为45g/L时，菌丝胞外多糖含量反而减少。可见蔗糖浓度过高或过低都会影响白蜡多年菌对碳素营养的吸收，导致胞外多糖含量降低。因此，最适宜白蜡多年菌产胞外多糖的蔗糖浓度为40g/L。

2.2不同氮源对菌丝产胞外多糖的影响由图3可知，不同氮源培养基中胞外多糖含量由高至低顺序为硝酸铵、硫酸铵、L-谷氨酰胺、尿素、硝酸钾。菌丝体在以硝酸铵为氮源的培养基中胞外多糖含量最高、为65.48g/L，极显著高于其他氮源培养基中的胞外多糖含量；当以硝酸钾为氮源时，菌丝胞外多糖含量最少、仅有22.48g/L。因此，白蜡多年菌液体发酵产胞外多糖的适宜氮源为硝酸铵。从图4可看出，当硝酸铵浓度小于1g/L时，菌丝胞外多糖的含量随着浓度的增加而增加；当硝酸铵浓度为1g/L时，胞外多糖含量最高、达87.15g/L，高于其他浓度；当硝酸铵浓度大于1g/L时，胞外多糖含量随着浓度的增加反而减少。可见，过量或过低的氮素营养不仅妨碍了菌丝对氮源本身的吸收，还影响了对其他营养物质的利用，影响了菌丝胞外多糖的产量。因此，为获得更多的胞外多糖，菌丝液体培养基中硝酸铵浓度以1g/L为宜。

2.3不同初始pH值对菌丝产胞外多糖的影响由图5可知，菌丝在初始pH为5.5~7.5范围的培养基内均可产生胞外多糖，在初始pH为5.5时菌丝产胞外多糖少，随着初始pH的增大，菌丝胞外多糖含量也不断增加。当初始pH为6.5时，胞外多糖量达到最高值、为36.61g/L。随着pH进一步升高，胞外多糖含量逐渐下降，当初始pH为7.5时，胞外多糖含量最少，仅有21.45g/L。因此，白蜡多年菌更适合在偏微酸性的环境中产生胞外多糖，最适初始pH为6.5。

2.4不同装液量对菌丝产胞外多糖的影响由图6可知，不同装液量对于菌丝产胞外多糖有重要影响，随着装液量的增加，菌丝胞外多糖含量也逐渐增加，当装液量为75mL/250mL时，菌丝产胞外多糖含量最多、为31.59g/L。但随着装液量的进一步增加，菌丝的胞外多糖含量急剧下降，当装液量为125mL/250mL时，胞外多糖含量达最低值，仅有3.5g/L。这可能是过多装液量影响培养液的氧量，导致菌丝生长不良而胞外多糖含量不高。因此，适于白蜡多年菌菌丝产胞外多糖的装液量为75mL/250mL。

2.5不同转速对菌丝产胞外多糖的影响从图7可以看出，随着转速的增大，胞外多糖含量逐渐增加。当转速为150r/min时，胞外多糖含量达到最大，为40.17g/L；但随着转速进一步增加，胞外多糖含量急剧下降，当转速为240r/min时，胞外多糖含量最低，仅有9.58g/L。可见，强力机械振荡会损伤细胞结构，也可能导致胞质营养交换过快，不利于菌丝生长及胞外多糖的分泌。因此，150r/min为白蜡多年菌菌丝产胞外多糖的适宜转速。

2.6不同培养温度对菌丝产胞外多糖的影响由图8可知，在18~27℃的温度范围内，随着温度的升高，胞外多糖含量逐渐升高，在27℃培养时胞外多糖含量最高，达到54.94g/L；但当温度超过27℃时，胞外多糖含量急剧下降，在30℃时胞外多糖含量仅有10.01g/L。温度对菌丝生长和代谢作用的影响较大，菌丝产胞外多糖最适宜的培养温度为27℃。

2.7不同培养时间对菌丝产胞外多糖的影响由图9可知，培养时间是影响菌丝产胞外多糖的重要因子。随着培养时间的增加，胞外多糖含量逐渐上升，培养9d后达到最大值，为31.46g/L。此后，随着培养时间的延长，菌丝老化，菌丝的产胞外多糖量也逐渐下降。因此，为获得较多的胞外多糖，培养时间以9d适宜。

2.8正交试验温度、起始pH、装液量、培养时间对菌丝胞外多糖含量影响的正交试验结果见表2。从表2的极差R可知，四因素对白蜡多年菌产胞外多糖的影响由大到小顺序为初始pH＞温度＞装液量＞培养时间，极差计算所得的产胞外多糖量较优的组合为A3B1C3D2，即温度27℃、起始pH5.5、装液量125mL/250mL、培养9d。对本试验确定的最佳培养条件组合进行试验验证，结果表明白蜡多年菌胞外多糖产量能维持在103.04g/L，比任一组正交试验的胞外多糖含量都高。

3结论与讨论

与菌丝固体培养相比，液体深层培养可以根据菌丝在生长过程中对碳源、氮源、生长因子等营养物质及温度、pH值、需氧量等条件的不同需要，合理配制，补加各种营养物质和随时调节温度、pH值和通风量，这就有可能把微生物培养过程的生长、代谢都控制在最佳状态而收到最好的培养效果。另外，与寄主培养、固体培养和代料栽培相比，白蜡多年菌液体培养是一种获得其多糖产物较为方便的途径，并且也比较容易对其培养条件进行优化及对其胞外多糖进行分离纯化。目前大多数的菌丝发酵研究采用液体培养的方法。本试验结果表明，白蜡多年菌的最适碳源为蔗糖，最适蔗糖浓度为40g/L，最适硝酸铵浓度为1g/L。由此可推知，该菌种适宜的碳氮比接近50∶1，这与前人对食用菌C/N值不大一致，这可能与菌种自身生理特性和培养的环境有关。在氮源试验中，当以硝酸铵、硫酸铵以及L-谷氨酰胺为氮源时，白蜡多年菌的胞外多糖含量较高，可见白蜡多年菌更喜好在导致培养基酸化的铵盐或酰胺盐中发酵产糖。从培养条件来看，通过对比单因素试验和正交试验结果可知，pH值的适宜范围为5.5~6.5。这符合前人对担子菌属的菌种生长探究中得出的担子菌对pH值的要求比较广泛的结论，但总体来说白蜡多年菌适合在偏微酸性的环境下生长。白灵菇在培养的第4天产胞外多糖量达到最大值，而生物量在第8天达到最大值。在本试验中，白蜡多年菌生物量在第7天达到最大值，产胞外多糖量在第9天达到最大值。可见对于白蜡多年菌来说，菌丝体生长优先于产胞外多糖，这与白灵菇明显不同。这说明白蜡多年菌的生长周期要比草菇菌和白灵菇长。有研究表明，多聚蛋白胨有利于灰树花的菌丝体和胞外多糖的的生产，在本试验中也发现同样的规律，加少量蛋白胨的培养基更利于白蜡多年菌产胞外多糖和菌丝的生长。

作者：梁冬秋 张翔宇 张松 单位：华南师范大学生命科学学院