浅谈多杀性巴氏杆菌免疫逃避机制范文

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摘要:多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起多种畜禽巴氏杆菌病，严重影响养殖业发展。该菌为了能在宿主体内建立感染，已具备了多样化的和复杂的策略来逃避宿主的免疫应答。已发现的多杀性巴氏杆菌的免疫逃避机制包括干扰或逃避宿主的吞噬作用，抵抗中性粒细胞、抗菌肽、补体介导的杀伤作用，降解免疫球蛋白或封闭抗体活性，形成生物膜等，除此之外，多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)还参与多种免疫逃避活动。本文就针对多杀性巴氏杆菌的免疫逃避机制做一综述。

关键词:多杀性巴氏杆菌;免疫逃避;吞噬作用;多杀性巴氏杆菌毒素;机制

动物的免疫系统与病原菌在相互斗争中共同进化，动物的免疫系统不断形成许多复杂的机制来消灭病原菌的感染，与此同时，病原菌也形成了多种复杂的策略来抑制或逃避宿主的免疫机制。多杀性巴氏杆菌作为引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，血清型众多，宿主广泛，分布广泛，能够使动物发生出血性败血病，传染性肺炎，萎缩性鼻炎，致死性纤维素性胸膜炎等［1］。该菌为了能在宿主体内生长、生存、传播，不断进化，并通过多种策略来逃避宿主免疫系统的杀伤作用。Cao等［2］对33株多杀性巴氏杆菌毒力相关基因的遗传内容和多样性进行了综合分析，结果表明致病性多杀性巴氏杆菌的进化动态是由达尔文阳性选择和同源重组驱动的，膜相关基因在所有正向选择的基因中高度丰富，可能与细菌逃避宿主免疫应答有关。免疫逃避可以阻断机体的先天性免疫应答以及获得性免疫应答，使病原菌能够在宿主体内持续感染，从而引发疾病。多杀性巴氏杆菌通过干扰或逃避宿主的吞噬作用，抵抗中性粒细胞、抗菌肽、补体介导的杀伤作用，降解免疫球蛋白或封闭抗体活性，形成生物膜来逃避宿主的免疫防御作用。除此之外，多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)还参与多种免疫逃避活动。本文针对多杀性巴氏杆菌的免疫逃避机制做一综述，以期为宿主－病原体相互作用提供有价值的靶点，为巴氏杆菌病的治疗和疫苗的研制提供依据。

1干扰或逃避吞噬作用

病原菌侵入动物机体后，非特异性免疫作为第一道防线进行防御作用，其中包括细胞吞噬和炎症反应。吞噬作用可消灭侵入机体的大部分病原菌，然而不被阻挡而侵入血液或其他脏器的病原菌，能够在一定程度上干扰吞噬细胞的活动，或以某种方式逃避他们的注意。病原菌有多种机制来避免吞噬细胞的吞噬和杀伤，它们阻碍吞噬作用的一个或多个方面，从而逃避宿主的免疫反应。

1.1抑制吞噬细胞的吞噬或摄取

多杀性巴氏杆菌的荚膜多糖够避免吞噬细胞的吞噬或摄取，用多杀性巴氏杆菌腹腔接种小鼠，无荚膜的菌株容易被小鼠腹腔巨噬细胞所摄取，在血液，脾脏和肝脏中有效地被清除，而有荚膜的菌株对吞噬作用有显著的抵抗力，能够迅速繁殖［3］。用鸡的巨噬细胞进行类似的试验，结果证实荚膜在抗吞噬作用上是非常重要的，但荚膜不是抗吞噬作用的唯一因素［4］。一般说来，多数有毒力的多杀性巴氏杆菌表达的荚膜包括透明质酸(HA)(血清A型和B型)，软骨素(血清F型)或肝素(血清D型)，与其动物宿主的相应成分在分子上具有相同的化学结构［5－6］。这种“分子拟态”能够降低宿主的吞噬功能，封闭抗体对荚膜多糖的应答反应，减少补体的杀伤作用，增强细菌在宿主中的黏附和存活。并且荚膜的存在和厚度直接影响多杀性巴氏杆菌抗吞噬的活性。除此之外，某些细菌与宿主的糖配体结合后，通过ATP依赖的胞质结合蛋白(含有非常保守的结合位点)和膜转运蛋白将唾液酸转运至胞质，再将其整合入细菌表面的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)末端［7－8］。细菌的表面结构如LOS经过唾液酸化作用后，能够伪装成机体成分，以“分子拟态”的形式降低网状内皮系统识别部件与细菌的相互作用，从而阻止固有免疫的识别和活化。Tatum等［9］报道多杀性巴氏杆菌能够运输，结合唾液酸到LOS上，细菌表层分子获取并整合入唾液酸残基是多杀性巴氏杆菌致禽败血症的关键特征，细胞表层结构不经过唾液酸化作用的多杀性巴氏杆菌容易被宿主识别并清除。除荚膜参与抗吞噬作用外，某些外膜蛋白也具有抗吞噬活性。多杀性巴氏杆菌及其有毒的外膜蛋白能够抑制鸟类外周单核吞噬细胞对白色念珠菌和多杀性巴氏杆菌的摄取和杀伤作用，用该有毒外膜蛋白的特异性抗体处理后，鸟类外周单核吞噬细胞对白色念珠菌和多杀性巴氏杆菌的摄取增加，并能对胞内的多杀性巴氏杆菌进行杀伤。相似的，荚膜血清B型菌体抗原2型(B:2)的多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白(OMP)，禽多杀性巴氏杆菌C48－3株外膜蛋白H，牛源A型多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白功能区均具有抗吞噬作用［10－12］。

1.2在吞噬细胞内生存或诱导细胞凋亡

病原菌进入机体后，吞噬细胞在趋化因子的作用下，向病原菌存在部位移动;病原菌通过调理作用后，被吞噬细胞吞入并杀灭和消化。但有的细菌被吞噬细胞吞噬后不被杀灭，甚至能在吞噬细胞内存活和繁殖。多杀性巴氏杆菌能够在单核吞噬细胞，巨噬细胞，中性粒细胞内存活［13－14］。细菌在细胞内存活的机制是细菌能够进入胞浆，抑制吞噬小体和溶酶体的溶解作用，干扰氧依赖的杀菌作用即呼吸爆发作用。Dowling等［14］从肺泡盥洗液中的巨噬细胞中检测到大量活的多杀性巴氏杆菌的存在，并且巨噬细胞几乎检测不到呼吸爆发反应。细胞内环境还可以使细菌抵抗细胞外的杀菌剂、抗体、毒物等的杀伤作用，能够在病原菌感染的初期或直至它们发展成一种完整的致病性因子时保护细菌。某些病原菌可以通过分泌毒素或蛋白酶来破坏吞噬细胞的细胞膜，或诱导细胞凋亡，或直接杀死吞噬细胞。将多杀性巴氏杆菌血清A:1型感染小鼠后，肺泡、肝脏中浸润的中性粒细胞和单核细胞出现了凋亡细胞核，脾脏中白髓部位凋亡细胞核大量存在［15］。多杀性巴氏杆菌通过诱导免疫细胞的凋亡，逃避吞噬细胞的吞噬作用。

2抵抗中性粒细胞、抗菌肽、补体介导的杀伤作用

中性粒细胞是血液中主要的吞噬细胞，在防御感染中起重要作用。Scapinello等［16］研究发现具有弹性蛋白酶活性的防御素和无弹性蛋白依赖的乳铁蛋白共同构成了猪中性粒细胞分泌物的杀菌作用，该分泌物能够有效杀伤无毒性的大肠杆菌K－12，但对多杀性巴氏杆菌缺乏有效的杀伤作用。抗菌肽是具有抗菌活性的短肽的总称，具有广谱的抗菌作用。细菌完整的脂多糖(LPS)结构，有助于细菌抵抗抗菌肽的作用。表达截短的LPS使多杀性巴氏杆菌更易受宿主的防御机制的影响，包括对抗菌肽更敏感［17］。截短了多杀性巴氏杆菌LPS主要寡糖的延伸部位，细菌对鸡抗菌肽fowlicidin－1的敏感性增强，高度截短表达LPS的菌株最敏感，能够完整表达LPS庚糖侧链的菌株在肌肉组织中存活更长时间［18］。表达于多种病原菌表层结构上磷酸胆碱(PCho)在细菌粘附和抵抗抗菌肽上具有重要作用。PCho能够降低流感嗜血杆菌对人下呼吸道表达的抗菌肽的敏感性。Chiang等［19］研究证实副鸡禽杆菌LPS上乙酸胆碱的表达能够减低副鸡禽杆菌对鸡抗菌肽fowlicidin－1的易感性。多杀性巴氏杆菌VP161和X－73菌株的LPS末端半乳糖残基上包含磷酸胆碱(PCho)。LPS缺少磷酸胆碱(PCho)的VP161突变株，在鸡感染模型中增殖减慢，并且相于野生型，对鸡的抗菌肽fowlicidin－1更加敏感［20］。其原因可能在于，带阳离子的抗菌肽必须与细菌的带阴离子的脂质A相互作用才能导致细菌溶解，LPS寡糖可能遮蔽了脂质A，从而增加了细菌的抵抗力。荚膜和外膜蛋白等结构在补体介导的杀菌作用中起作用。多杀性巴氏杆菌血型A型X－73野生型菌株对鸡的血清具有抵抗力，然而无荚膜的突变株对血清敏感［21］。但Boyce等［22］报道，多杀性巴氏杆菌血清B:2型M1404野生型和无荚膜型菌株均能抵抗牛和鼠血清中补体介导的杀伤作用。禽巴氏杆菌靠其菌体表面的外膜蛋白H(OmpH)能够逃避机体血清补体介导的杀菌作用［11］。

3降解免疫球蛋白或封闭抗体活性

分离自牛、鸡、羊、猪的多杀性巴氏杆菌能够分泌蛋白酶到培养基中，来自不同分离株的蛋白酶能够降低IgG活性［23］。来自人肺炎和生殖器感染的2株多杀性巴氏杆菌分泌的蛋白酶能够裂解人的IgA和IgG，主要是裂开重链外的铰链区。基于这样的结果，研究者推测多杀性巴氏杆菌的蛋白酶在细菌富集于组织方面发挥了重要的作用。用多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白(OMPs)免疫小鼠，保护率可达到80%以上，用重组OmpA免疫，可达0至53%的保护率，将重组OmpA混合于外膜蛋白疫苗中免疫小鼠，保护率减少30%～60%［24］。同样的，用多杀性巴氏杆菌重组OmpA免疫小鼠，能够刺激小鼠产生强烈的Th2型免疫反应，产生高滴度的IgG1，但是对同型菌的攻击缺乏保护力;与OMPs疫苗联合免疫后，对OMPs疫苗效力产生有害作用［25］。用提纯的OmpA家族成员OMP28来进行试验，结果相似［26］。OmpA与OMPs疫苗联合使用过程中，OmpA能够封闭OMPs疫苗产生的免疫保护性抗体，降低抗体活性，从而使多杀性巴氏杆菌逃避宿主的防御反应。

4形成生物膜细菌生物膜

通过分泌胞外聚合物形成包裹细菌的保护层，导致生物膜内部细菌代谢率低，分裂缓慢，对外界刺激反应迟钝，对宿主免疫系统和抗菌药物具有很强的抵抗力。据报道，牛源A型多杀性巴氏杆菌可以形成生物膜，假定脂蛋白pm0979在强毒株内高表达，参与多杀性巴氏杆菌生物膜的形成［27］。三聚体自转运粘附素是革兰阴性菌中的一种外膜蛋白，牛源A型多杀性巴氏杆菌的三聚体自转运蛋白抗体可以抑制细菌生物膜形成［12］。生物膜在机体一个或多个部位缓慢生长，其内细菌释放抗原刺激机体产生抗体，但此抗体不足以杀死生物膜中的细菌，而且可形成免疫复合物损伤周围组织，即使机体的细胞和体液免疫反应很完善，因生物膜包裹在细菌外起到物理屏障作用，使免疫系统因难以接触到细菌而发挥不了作用。

5PMT的免疫逃避作用

多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)主要由多杀性巴氏杆菌血清D型产生，在临床上导致猪萎缩性鼻炎。PMT是146kDa的蛋白，包含3个活性区域，N端的受体结合位点，跨膜区域，C端的催化位点，当PMT结合到细胞表面受体之后，受体介导细胞内摄作用，PMT进入细胞内。PMT的作用底物是异源三聚体G蛋白的α亚基，PMT通过硫蛋白酶样作用催化谷氨酰胺脱酰胺作用，改变异源三聚体G蛋白Gαi，Gαq/11以及Gα12/13的Gα亚基，再通过活化的Gα亚基使分子信号通路级联放大，参与一系列的活动。PMT导致猪萎缩性鼻炎的机制在于PMT破坏了骨组织内成骨细胞和破骨细胞的动态平衡，骨组织的吸收功能增强，逐渐萎缩或消失，并被增生的间质组织取代，从而猪鼻部表现为扭曲、变形、萎缩等。Hildebrand等［28］认为PMT的破骨性质起因于骨细胞和淋巴细胞的互相干扰，B细胞可能是多杀性巴氏杆菌的一个重要目标。此外，PMT是来自单核细胞和巨噬细胞谱系细胞的有效破骨细胞诱导剂，不依赖于一种被认为是触发骨破坏发生不可或缺的因子即核因子－κB受体活化因子配体(RANKL)，就可能将骨髓衍生的巨噬细胞分化成功能性破骨细胞［29］。通过对PMT分子路径的进一步了解以及使用不同的体外模型，PMT对骨的平衡调节作用是病原逃避宿主免疫反应的重要策略［30］。PMT作为一种有丝分裂原，能够操作其动物宿主的信号转导级联，通过诱导丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白(pim－1)的表达，破坏细胞信号传导抑制因子－1(SOCS－1)的活性，上调酪氨酸激酶(JAK)和信号转导及转录激活因子(STAT)的活性［31］。除此之外，PMT能够抑制由星状孢子素诱导的细胞凋亡，阻滞由化疗剂诱导的人癌症细胞系的凋亡。PMT是高度有效的抗细胞凋亡剂，具有潜在的致癌作用［32］。Hildebrand等［31］推测PMT使用致癌的JAK－STAT信号转导机制来改变宿主细胞信号，其目的是为了避免宿主的免疫防御机制。PMT影响免疫系统的多种细胞，其能够诱导树突状细胞的成熟，但却阻断了树突状细胞到局部淋巴结的趋化运动，这是一种限制T细胞应答，减少B细胞体液免液亲和力的有效的机制，使病原具有生存优势［33］。用PMT刺激鼠类骨髓细胞，能够产生具有B细胞特征和巨噬细胞特征的2种细胞群，这2种细胞群是PMT的主要靶细胞［34］。PMT能够选择性的影响B细胞，通过改变细胞内信号通路来干扰他们的分化，影响抗体的产生，从而使多杀性巴氏杆菌能够逃避宿主的免疫反应。据Jordan等［35］和Bagley等［36］先后报道，PMT会抑制动物的体液免疫反应，使PMT试验组动物的IgG水平显著下降。以PMT为佐剂，口服免疫接种卵清蛋白，抗体的产生受到抑制，提示PMT不是一种良好的佐剂。另外，PMT也能减少其他毒素如霍乱毒素对卵清蛋白的佐剂效应［35］。Toll样受体4(TLR4)通过识别多杀性巴氏杆菌LPS介导的信号级联能够诱导大量的炎性因子和抗原递呈细胞(APC)上的共刺激分子的表达。PMT通过激活异源三聚体G蛋白，抑制受TLR4诱导的IL－12p40产物的产生，不仅直接影响辅助性T细胞的分化，而且影响T细胞对LPS处理的单核细胞的激活能力［35，37］。通过Gq活化和STAT－3的下游激活，PMT能够触发幼稚T细胞分化成促进破骨细胞生成的Th17表型［38－39］。除此之外，PMT也可以直接调控CD4+Th细胞。细菌通过PMT把具有高度可塑性的T细胞作为目标来加强其致病性，使其获得存活和繁殖的优势［40］。

6结语

多杀性巴氏杆菌能够引起多种畜禽巴氏杆菌病，该菌通过一系列免疫逃避机制，干扰宿主的免疫系统，突破机体的防御屏障，在体内定殖、繁殖、扩散，引起宿主细胞的破坏而致病。一直以来，研究者们都致力于研究该菌毒力因子，已报道的毒力因子有荚膜，脂多糖，粘附素和菌毛，外膜蛋白，铁调节和获得蛋白(IROMPs)，胞外酶，多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)，透明质酸酶等［1］，但对该菌的免疫逃避机制缺乏系统性的研究与总结。随着各种分子生物学、蛋白和基因工程技术的发展，对多杀性巴氏杆菌抗原和毒力因子研究的不断深入，其免疫逃避机制必将获得长足发展。全面深入地研究多杀性巴氏杆菌的免疫逃避机制将有助于高保护力疫苗的研制，同时为巴氏杆菌病的生物防控提供信息。

作者：邹灵秀；朱剑宗；潘雨；邓彦飞 单位：广西大学动物科学技术学院