犬细小病毒单克隆抗体的制备及应用范文

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《动物医学进展杂志》2016年第9期

摘要：

为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸，将F81细胞中分离的CPV免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立间接ELISA方法筛选分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得1株能稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3E2。3E2的亚类为IgG1型，腹水抗体效价为1．8×105，交叉试验表明，3E2可与CPV特异性结合，与其他犬常见病毒无交叉反应。用3E2单克隆抗体制备的检测CPV的胶体金免疫层析试纸条特异性良好，为诊断和研究CPV奠定了基础。

关键词：

犬细小病毒；病毒分离；单克隆抗体；胶体金免疫层析试纸

犬细小病毒病是由犬细小病毒所引起的传染性疾病，可通过直接或间接接触传播，以剧烈的呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特点，可引起犬急性心肌炎。犬细小病毒传播性强，发病率和病死率较高，且可感染狐、貉、狼等动物，对养犬业和皮毛动物等经济动物养殖业可造成巨大经济损失［1］。1977年，美国科学家最先从患肠炎的犬粪便中分离出CPV。1983年，徐汉坤等首次报道了犬细小病毒病在我国的出现。CPV在分类上属细小病毒科，病毒呈圆形或六边形，无囊膜，直径约25nm。病毒颗粒具有球型的衣壳，衣壳内包含单链线状DNA，在DNA两端各有一个发夹样的回文结构，DNA量占整个病毒粒子重量的25％～34％。CPV基因主要编码结构蛋白VP1、VP2、VP3和非结构蛋白NS1、NS2。VP1和VP2构成病毒的衣壳，其中VP2是主要结构成分和免疫原性蛋白，能够促使机体产生中和抗体［2］。VP1和VP2蛋白对病毒与宿主细胞之间的识别起重要作用，删除VP1或VP2蛋白的突变体均失去了对宿主细胞的感染能力。近年来，CPV非结构蛋白NS1被认为在病毒的致病性和细胞毒方面起主要作用，并在体外可引起肿瘤细胞凋亡［3－5］。目前国内外对犬细小病毒的诊断主要通过临床症状诊断、血常规检查和试纸快速诊断等，前两者存在着依赖临床经验、特异性低等缺点，难以达到对犬细小病毒病快速诊断的要求；而快速诊断试纸条主要被国外产品所垄断［6］。本研究用F81细胞分离的CPV制备获得了单克隆抗体，并用单克隆抗体，初步制备了CPV的胶体金层析快速检测试纸条。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物、细胞株及毒株

猫肾细胞系细胞（F81），购自中国兽医药品监察所；犬细小病毒病料，河南牧业经济学院动物医院提供；SP2／0多发性骨髓瘤细胞，河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室保存；Balb／c小鼠和日本长耳大白兔，购自河南农业大学实验动物中心；含有CPVVP2基因的重组质粒pGEX－6p－1－VP2，河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室构建并保存；犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）和犬腺状病毒（CAV），河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室鉴定并保存。

1．1．2主要试剂与药品

dNTP、DNA提取试剂盒、琼脂糖、DNAMarkerDL2000和蛋白分子质量标准等，宝生物工程（大连）有限公司产品；DMEM、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、50倍HAT贮存液，GIBCO公司产品；胎牛血清，Hyclone公司产品；HRP－羊抗鼠IgG、HRP－羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗体、PEG4000、DMSO、BSA及氯金酸，Sigma公司产品；硝酸纤维素膜（NC膜），Millipore公司产品；样品垫和PVC底板，上海金标生物科技有限公司产品；SBAClonotypingSystem／HRP抗体亚类鉴定试剂盒，SouthernBiotechnology公司产品；引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；CPV多抗IgG由河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室制备；犬细小病毒阴性血清由河南牧业经济学院动物医院提供；其他常规用试剂为国产或进口分析纯。

1．2方法

1．2．1病毒的鉴定

样品由河南牧业经济学院动物医院提供。采集出现血便、高热等疑似CPV感染的犬粪便，加入适量磷酸盐缓冲液，5000r／min离心10min，收获上清液。按常规DNA提取方法提取DNA，置于－20℃保存备用。参照CPV基因序列（基因登录号：M19296．1），设计引物序列为：上游引物P1：5′－AATCACAGCAAACTCAAG－CAGAC－3′；下游引物P2：5′－TAGCAAATTCAT－CACCTGTTCTTAG－3′。以提取的DNA样品为模板，使用Taq酶扩增，反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环；最后72℃10min。取PCR反应产物5μL用10g／L琼脂糖凝胶电泳观察结果［7］。

1．2．2病毒的分离和抗原的制备

将采集的病料加入含1000单位／mL青霉素和链霉素的DMEM细胞维持液（含20mL／L胎牛血清）制成1∶9的悬液，混匀后5000r／min离心20min，取上清，用0．22μm微孔滤膜过滤，置－20℃保存备用。将单层的F81细胞用胰蛋白酶消化，按1∶2传代，按体积10％的病料上清同步接种F81细胞，置37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，设立阴性对照，同时逐日观察细胞病变并进行盲传［8－9］。待细胞病变达到80％以上时，反复冻融3次，10000r／min4℃离心30min，收获上清，加入PEG6000浓缩，经过Sepharose4FF凝胶柱层析，收集洗脱峰即为CPV抗原，紫外分光法检测CPV浓度，保存于－80℃。

1．2．3间接ELISA检测方法的建立

以纯化的VP2蛋白作为包被抗原［10］，采用方阵滴定确定阳性血清的最佳浓度和最佳抗原包被浓度，建立了间接ELISA方法。通过酶标仪读取OD值判定结果，以OD待检血清＞0．4且P／N≥2．1为阳性判定标准。另外检测30份犬细小病毒阴性血清450nm波长处的OD值，并将平均OD值与3倍的标准差（SD）之和作为阴阳性的临界值，即珚x＋3SD为确定的阴阳性界限［11］。

1．2．4小鼠的免疫

将纯化的CPV抗原加等体积弗氏完全佐剂初次免疫6周龄Balb／c小鼠，每隔2周分别再注射2次以加强免疫。细胞融合前3d再加强免疫1次注射抗原。

1．2．5杂交瘤细胞的筛选和McAb腹水制备

按常规方法进行细胞融合，使用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆化培养，选择能够稳定分泌、效价较高的单个克隆进行培养。按常规方法制备腹水，并采用辛酸－硫酸铵盐析法和亲和层析法纯化腹水中的McAb［12］。

1．2．6McAb亚型鉴定及染色体计数

①采用SBAClonotypingSystem／HRP抗体亚类鉴定试剂盒测定制备的CPVMcAb的Ig亚类。②选择生长良好的杂交瘤细胞，用秋水仙素阻断法进行染色体核型分析，在显微镜下选择染色体分散良好的细胞观察计数。

1．2．7McAb的特异性分析

将犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CPV）、犬冠状病毒（CPV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）作为包被抗原进行间接ELISA，检测该单克隆抗体的特异性。

1．2．8胶体金抗体的制备

将200mL0．1g／L氯金酸溶液，搅拌加热至沸腾，迅速加入2mL10g／L柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄逐渐变黑，然后变红，继续煮沸10min，溶液冷却后微孔滤膜过滤，4℃下保存备用。将制备的胶体金，调整pH至8．0后加纯化后的3E2单抗搅拌，室温静止5min，经低温高速离心法纯化获得胶体金抗体［13］。

1．2．9免疫试纸条的制备和初步鉴定

在玻璃纤维上喷涂胶体金抗体。取蛋白浓度为1．5mg／mL的CPV多抗IgG标记在硝酸纤维素膜上，设为检测线；取蛋白浓度为1．0mg／mL的羊抗鼠IgG抗体喷在离检测线5mm处，即为质控线；将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜与样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水纸组装成试纸条。取PCR和ELISA鉴定的犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV），用制备的胶体金试纸条进行检测，验证其特异性。

2结果

2．1PCR鉴定

通过PCR扩增，得到608bp左右的预期大小目的片段，经测序与预期序列一致，证明样品中含有CPV（图1）。

2．2病毒的分离

从第3代开始一般会出现规律性细胞病变，接种病料上清液后约24h～36h，细胞出现弥散性颗粒，胞浆收缩，细胞变圆；约48h病变细胞开始逐渐拉网、崩解、脱落；约72h～96h，细胞病变达80％以上时，收毒，置－80℃保存备用（图2）。

2．3间接ELISA方法建立

采用方阵滴定确定抗原的最佳包被浓度和阳性血清最佳稀释度，阳性判断标准为OD待检血清＞0．4，且OD待检血清／OD标准阴性值≥2．1，当抗原的稀释浓度为1∶160，血清的稀释度为1∶80，阴性与阳性血清的OD450nm值相差最大（P／N＝9．253）。建立了筛选犬细小病毒McAb的间接ELISA方法（表1）。

2．4杂交瘤细胞株的筛选

经脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0细胞融合并筛选，获得1株能高效分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3E2。间接ELISA检测，3E2腹水效价为1∶1．8×105。

2．5McAb的Ig亚类鉴定检测

抗体的Ig亚类，结果表明，3E2亚类为IgG1型。

2．6杂交瘤细胞染色体数目

Balb／c小鼠脾细胞的染色体为40条，SP2／0骨髓瘤细胞的染色体为62条。统计结果表明，该细胞株染色体数介于90条～100条，大约为小鼠脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞染色体数目之和，说明为两者融合产生（图3）。

2．7McAb的特异性检测

将3E2分别与犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）包被的ELISA板进行交叉反应试验，结果发现，3E2与CPV可发生阳性反应，与CDV、CCV和CAV不发生反应，表明制备的McAb与其他犬常见病毒没有交叉反应，制备的3E2单克隆抗体有良好的特异性（表2）。

2．8胶体金溶液的制备

制成的胶体金溶液日光下肉眼观察透明清亮、颜色为酒红色、无沉淀。经紫外分光光度计检测其最大吸收波长为525nm。

2．9胶体金免疫层析试纸的特异性

特异性试验结果显示犬瘟热病毒（CDV）、犬冠状病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）在胶体金免疫层析试纸检测线上均无条带，为阴性。犬细小病毒（CPV）在检测线上均出现特异性条带，为阳性（图4）。

3讨论

犬细小病毒病传播性强，发病率和病死率较高，且一年四季都有发生，绝大多数年龄、品种的犬类都可被传染，但幼犬和纯种犬更易被感染，病死率也高［14－15］。细小病毒感染犬类后，一旦发病治愈率特别低，没有特效药，早期确定犬细小病毒病并予以抗病毒、消炎、补液和止呕等治疗，可以提高疗效和存活率，因此，对CPV的早期检测就非常关键［16－19］。胶体金免疫层析试纸检测方法只需将待测溶液加入试纸条中，静止后一段时间观察结果，不需要仪器设备来读取结果，不需要操作者有专业技能，能减少很大检测工作量和节省大量检测费用，敏感性高，特异性好［20］。但目前我国市场上部分CPV试纸条主要以国外进口为主，价格较为昂贵，市场较为广阔。我们以分离得到并纯化的CPV为抗原，多次腹腔注射免疫小鼠获得了能够分泌抗CPVMcAb的脾细胞，ELISA试验结果表明该杂交瘤细胞产生的McAb只与CPV发生特异性反应，与CDV、CCV和CAV无明显的交叉反应，表明制备的3E2单克隆抗体有良好的特异性。另外，经间接ELISA检测，3E2腹水效价为1∶1．8×105。本试验确定了标记的最佳条件，设定3E2为金标抗体、取蛋白浓度为1．5mg／mL的CPV多抗IgG标记为检测线，蛋白浓度为1．0mg／mL的兔抗鼠IgG高免血清标记为质控线，初步建立了胶体金免疫层析方法。本试验建立的诊断方法特异性强，与其他3种犬常见病毒抗原无交叉反应，具有较好的重复性，与ELISA方法结果一致，可用于CPV的快速检测。下一步我们将在反应条件、稳定性及工艺上进一步改进，以期进一步提高检测灵敏度。本研究分离并纯化了CPV，经免疫Balb／c小鼠后，通过杂交瘤技术获得了1株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞，经鉴定制备出的McAb效价高、特异性强。并在此基础上研发了胶体金免疫层析检测试纸条，快捷准确，在临床上具有很好的应用前景，有一定的社会和经济价值，并为犬细小病毒的深入研究奠定了基础。

参考文献：

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作者:马辉 权国辉 乔宏兴 郑鸣 赵绪永 王永芬 边传周 单位:河南牧业经济学院生物工程学院 郑州职业技术学院材料工程系