烟蚜茧蜂多分DNA病毒的形态特征范文

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《东北农业科学杂志》2016年第一期

摘要：

多分DNA病毒（polydnavirus,PDV）是一类共生于膜翅目姬蜂科、茧蜂科和蚜茧蜂科寄生蜂体内的昆虫病毒。在寄生过程中，伴随着蜂卵的产出，寄生蜂将PDV注入寄主体内，通过病毒基因的表达，破坏寄主的免疫，以保障后代的存活。本文首次在烟蚜茧蜂和蚜虫模式体系内发现多分dna病毒，初步明确其形态特征和生理效应。

关键词：

烟蚜茧蜂；多分DNA病毒；形态特征；生理效应

PDV被寄生蜂注射入寄主昆虫体内，能调节寄主的生理功能，保证寄生蜂在寄主体内的成功发育[1]。研究表明，在寄生蜂寄生寄主昆虫过程中，多种调控因子参与以保证寄生蜂成功寄生[2-4]。其中,多分DNA病毒直接侵染或间接作用于寄主浆细胞和颗粒细胞，改变寄主血细胞行为，抑制寄主的细胞免疫反应，使蜂卵免遭包囊[5-6]。PDV的这种免疫抑制作用方式在不同的系统是不同的。要进一步研究PDV对于调节寄主免疫及其他生理功能的机理，对其在寄主组织中的侵染及表达情况进行检测是必不可少的[7]。笔者实验室建立烟蚜茧蜂和烟蚜系统，发现在烟蚜茧蜂雌蜂卵巢内亦含有PDV，在寄主体内不能复制但可以进行表达，以原病毒的形式整合在寄生蜂基因组中，并垂直传播给下一代，雄蜂也能够通过交配将其所含的病毒基因组传递给下一代雌蜂。本文就在烟蚜茧蜂体内首次发现并对PDV进行分离提纯并进行鉴定以及明确其生物学功能，以期将来进行更有效的研究，并揭示其作用机制。

1试验材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试虫源采用大小为（2×2×4）m3的双层繁蜂室（实验室自行设计）放置50盆（Φ=6～7cm）栽萝卜，当萝卜长成高于5cm时接入经鉴定的蚜虫，经蚜虫扩繁后，接入烟蚜茧蜂使其扩繁；栽植的萝卜视其生长情况进行更换，更换时将带蚜叶片取下粘附在新生长的叶片上，当蚜量增多时也可自然转移。每天收集僵蚜1次，置于大型指形管（Φ=2.5cm,h=10cm）中，放于0℃冰箱中备用。

1.1.2烟蚜茧蜂卵巢的获得待烟蚜茧蜂羽化出蜂后，取200头雌蜂放于-20℃冰箱中5min使其麻醉，置于滴有1滴无菌生理盐水的载玻片上，用尖嘴镊子将腹部取下，解剖腹部末端，得到雌蜂生殖系统，将卵巢及输卵管取下，用无菌生理盐水清洗后放入冰浴的Ringer's溶液中。将解剖得到的卵巢放于玻璃匀浆器中匀浆，连同生理盐水吸入离心管中。

1.1.3紫外光辐射处理雌蜂用30W紫外灯光照射交配过的200头雌蜂3h，分别寄生100头3～4龄若蚜。随后按上述方法让其寄生2龄末、3龄、4龄初若蚜，每日解剖20头被寄生各龄期寄主，观察各处理寄生蜂卵孵化情况。以未经照射处理的正常雌蜂寄生的同龄若蚜做比较，观察假寄生对寄主若蚜发育的影响，同时以未寄生的同龄若蚜作对照[8]。

1.1.4被寄生蚜虫的解剖将上述3～4龄若蚜200头分别放到100个指形管（Φ=1.0cm，h=5.0cm）中，再分别引入100头雌蜂，使每个指形管中有2头蚜虫和1头雌蜂，持续产卵1h后，取出被寄生的烟蚜，放在75%的酒精中消毒，再用无菌生理盐水清洗除去杂质及酒精，然后将烟蚜放在滴有4℃冰冷的无菌生理盐水的载玻片上，用解剖针剔除虫体的前胸和翅，以一针按住腹部前端的腹面，用另一针自腹部前端背面起，轻轻拉开蚜虫体壁，再用自制的毛细吸管将血淋巴吸入到冰冷的离心管中备用。

1.2试验方法

1.2.1PDV的分离纯化PDV的分离纯化参照Krell和Beckage等的方法[9-10]。用TL-18M型台式高速冷冻离心机在8000r/min离心3min，以去掉组织碎片，沉淀用Ringer's溶液洗1次后再离心1次，合并上清液，作为提纯PDV的样品。将样品铺在25%～65%（W/V）的蔗糖连续梯度上，用Hitachi,P50离心机在48000r/min（HITA⁃CHISCR20BC冷冻高速离心机HirachikokiCo.LTd.,TokyoJapan日立RP30A转头）4℃下离心6h。用毛细管收集沉降带后，再用Ringer's溶液洗1遍，在48000r/min4℃下再离心30min，将沉淀溶于适量的Ringer's溶液中，于-70℃冰箱保存。

1.2.2镜检

1.2.2.1取材取上述所得的上清液，倒少量置于蜡板上的双蒸水中，静置15min，使其自行扩散成悬浮液。

1.2.2.2制样将敷有福尔莫瓦膜的载网漂浮在样品液滴上以沾取样品，用滤纸吸干余液，使样品在载网上仅有一薄层液膜；同时，用2%磷钨酸（pH6.8）染色1～2min,用滤纸吸干多余的染液。

1.2.2.3微形态观察在透射电子显微镜下进行微形态观察。

2结果与讨论

2.1形态学特性用蔗糖密度梯度离心法提纯的病毒，可在第3条沉降带（蔗糖40%浓度）出现。经电镜观察，收集的沉降带及烟蚜茧蜂卵巢萼液中的病毒粒子如图1、图2所示。该病毒粒子呈多面体状，数量较少，无包涵体。可初步证明在烟蚜茧蜂卵巢萼液中有毒粒子存在。被寄生的桃蚜体内毒粒子呈多面体，形状与烟蚜茧蜂卵巢萼液中毒粒子相似，可认为该病毒粒子是烟蚜茧蜂产卵时携带进来的。蚜茧蜂卵巢萼液和被寄生的蚜虫体液经过离心处理，经负染色，在透射电子显微镜下可观察到病毒粒子，经确认是多分DNA病毒（图3）。本研究取材仅有100对烟蚜茧蜂的卵巢，经梯度离心提纯后，病毒粒子的浓度较小，因此在用电镜观察到的病毒粒子较少，应取材更多。

2.2生理效应经紫外光处理后的雌蜂都能正常产卵寄生，对被寄生寄主的发育历期进行连续解剖发现，96.4%±2.8%不能孵化，个别发育不完善，并且绝大多数的蜂卵未能被寄主的免疫系统所识别而进行血细胞包囊。假寄生的2龄末、3龄和4龄初寄主若虫期延长，对一次假寄生的寄主而言，若虫期延长8～12d，而多次假寄生的寄主，当发育到第11d后，转化成僵蚜，说明PDV与复合因子剂量增加对寄生生长和发育有明显抑制作用[11]。4龄末蚜虫若虫被假寄生后，即使被过寄生6次，依然能正常发育，但随后转化成僵蚜（图4）。

3结论与讨论

本文证实烟蚜茧蜂体内存在多分DNA病毒，其功能是直接侵染或间接作用于寄主浆细胞和颗粒细胞，改变寄主血细胞行为，抑制寄主细胞免疫反应，破坏寄主免疫，使蜂卵免遭包囊以确保子代存活，对寄主生长和发育有明显抑制作用。在病毒与寄主昆虫长期进化过程中，PDV可通过调节寄主的内分泌来加快或减慢寄主的发育等途径来调节寄主幼虫生长期的长短，如可通过降低保幼激素酯酶的活性[12]。但对于烟蚜茧蜂和蚜虫模式体系内PDV是如何作用于寄主，是否整合于寄生蜂的染色体上，进入寄主体内是以何种方式进行转染及表达[13-14]，以上所有情况尚需作进一步的研究。未来在完全明确多分DNA病毒基因的功能和表达调控机理的基础上，可选用合适的昆虫转座子，以显微注射等方法将多分DNA病毒基因整合到害虫基因组中，培育出免疫力和繁殖力下降，发育紊乱的害虫品系，通过在田间散发这种转基因害虫，以达到控制种群的目的[15-16]。多分DNA的应用前景比较广阔，对它做进一步研究很有价值和意义[17]。

作者：李艳红 刘金文 颜秀娟 单位：吉林农业工程职业技术学院 吉林省农业科学院