野大麦种子人工老化处理的影响范文

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《草地学报》2015年第六期

摘要：

以带Epichloё内生真菌和不带Epichloё内生真菌的野大麦（Hordeumbrevisubulatum）种子为试验材料，在58±1℃和100％相对湿度条件下设置0，5，10，15，20，25，30和35min人工老化时间，研究老化过程中种子的活力变化以及内生真菌对种子的生理影响。结果表明：在人工老化过程中，种子的发芽率、发芽势、胚芽胚根长和活力指数随老化时间增加而降低；浸出液的电导率和可溶性糖含量随老化时间的增加而增加，且与发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数呈极显著负相关（P＜0．01），但被内生真菌侵染的种子其老化生理反应变化明显有所减缓。研究认为，与未被内生真菌侵染的种子相比，内生真菌可促进野大麦的发芽，促进芽长根长的生长，降低膜的损伤，减少浸出液电导率和可溶性糖的含量，从而降低种子的劣变程度，延长种子贮藏时限。

关键词：

内生真菌；野大麦；种子；人工老化；活力

禾草内生真菌（grassendophyte；fungalendo－phyte；endophyticfungi）是指在禾草体内渡过整个或者大部分的生命周期，而禾草自身不显示外部症状的一大类真菌［1］。内生真菌与植物形成互惠的关系，一方面可促进植物生长发育、增强植物的抗逆性和非生物胁迫的能力［2－3］，另一方面从宿主中吸收营养供自己生长需求。绝大多数内生真菌通过种子进行传播［4］，多存在于禾草的地上组织。野大麦（Hordeumbrevisubulatum）是禾本科大麦属优良的多年生禾本科牧草，多分布于我国东北、华北及新疆等低湿草地上，表现为生长期短、适口性好、耐盐碱［5］、草质柔软、生产性能良好，具有较高的经济利用价值［6］，是一种良好的放牧－刈割兼用的多年生禾本科牧草。禾草和内生真菌的共生不仅为内生真菌提供了营养、生存环境及繁殖载体［7］，也促进了禾草的生长，防止或减少食草动物的采食，提高了其抗逆性。Wilson等首次在野大麦中发现了内生真菌［8］，内生真菌的侵染可显著提高野大麦抗虫［9］、耐盐［5］等逆境条件抗逆性。

种子老化指的是种子发育完成其生理成熟期，其活力达最高水平，随着时间及其环境的变化，引起种子内部生理生化过程的变化，活力不断下降直至丧失生命力的综合效应［10］。引起种子老化的原因主要有：贮藏物质的变化、代谢中产生有毒物质含量的变化、能量的变化、生物膜系统的变化、酶活性的变化及遗传物质的改变等［11］。种子活力是决定种子萌发及其生长表现的重要特征，是反映种子老化水平的主要指标之一，在种子贮藏管理中具有重要的意义［12］。目前对于种子活力的检测主要集中在对其物理特性（种子质量、颜色、大小等）、发芽特性（芽长、发芽率、发芽势、发芽指数等）及生理生化特性（浸出液电导率、浸出液可溶性糖等）的测定。其中浸出液电导率的高低是反映老化过程中膜透性变化的重要指标；同时老化过程中可溶性糖的含量随着种内贮藏物质的变化而变化，是评价贮藏物质变化的主要指标之一［13］。研究表明，内生真菌的侵染能促进种子的萌发，并提高其胚根、胚芽的长度及其幼苗的生物量［14－15］。相对于自然老化，人工老化有效缩短了处理周期，并且在模拟自然储存种子的环境中人为进行老化处理，在短时间内进行高温高湿处理，势必会引起种子内部生理反应的差异［16］。对于探索种子老化过程机理以及寻找有效减缓种子活力下降方法具有重要的意义。本试验以野大麦为试验材料，采用人工模拟自然老化过程的方法，研究内生真菌在人工快速老化条件下对野大麦种子活力的影响，以期利用内生真菌在种子贮藏中的应用为种子的储藏提供参考。

1材料与方法

1．1试验材料供试材料野大麦于2013年采自甘肃省河西走廊的兰州大学临泽试验站（E100°06′04″，N39°11′07″，海拔1783m），参照李春杰等［17］的方法对野大麦茎髓部进行内生真菌的检测，收集带内生真菌（E＋）与不带内生真菌（E－）野大麦种子，4℃保存于农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州），以保证种带内生真菌的活性。

1．2人工老化处理随机挑选带菌（E＋）与不带菌（E－）野大麦种子，在58±1℃和100％相对湿度条件下进行人工快速老化处理。老化时间分别为0（对照CK），5，10，15，20，25，30和35min，取出处理完成的种子在室温条件下进行晾晒3至4天，使种子含水量尽量恢复至原始状态，然后进行各项指标的测定。

1．3测试项目及方法

1．3．1萌发测定采用纸上（TP）发芽法，随机挑选老化处理过的带菌（E＋）与不带菌（E－）种子各50粒于事先灭菌的培养皿进行萌发测试，各处理4个重复。参照卫东和王彦荣的方法［18］，放入光照培养箱（LRH－250－G）中，在25℃（恒温）条件下进行测定，试验持续12天，试验期间保持滤纸湿润，每天记录种子发芽数，在种子发芽后的第5天测量胚芽长度（cm）和胚根长度（cm），统计发芽数，分别计算种子发芽势、发芽率和活力指数。12天野大麦种子发芽结束后，最后统计发芽数并计算终期发芽率。发芽率＝发芽种子数／供试种子数×100％发芽势＝第5天发芽种子数／供试种子数×100％活力指数＝（平均胚芽长＋平均胚根长）×发芽率

1．3．2浸出液电导率的测定分别挑选老化处理后的E＋、E－野大麦种子各50粒，3次重复，称量（精确到0．001g）后用去离子水冲洗3次，置于150mL三角瓶中，加入100mL的去离子水，用封口膜封住瓶口，设空白对照（100mL的去离子水），于20℃下静置24h备用。参照国际种子检验协会《种子活力测定方法手册》［19］有关电导率的测定方法，用DDSJ－308A型数字式电导率仪测定浸出液的电导率［μs•（cm•g）－1］。浸种液电导率＝（样品电导率－对照电导率）／样品质量

1．3．3浸出液可溶性糖的测定参照李合生等［20］的方法，对老化处理后的野大麦种子可溶性糖含量进行测定。分别取老化处理后的E＋、E－野大麦种子0．5g置于150mL的三角瓶中，加100mL的去离子水，锡箔纸加盖后在20℃恒温下24h。分别移取各处理后的浸种液1mL于试管中，加入蒽酮试剂5mL，小心震荡，使液体混合均匀，至沸水浴中10min后取出冷却至室温。以对照调零，采用紫外－可见分光光度计（WF－ZUV－2102型）在波长620nm下测光密度值，结合可溶性糖的标准曲线计算浸出液可溶性糖含量（μg•g－1）。

1．4数据处理和统计分析试验所得数据录入Excel2007并制图，采用SPSS17．0软件进行差异显著性分析及相关性分析，并用Duncan法对各活力指标进行多重比较。

2结果与分析

2．1内生真菌对野大麦种子萌发和幼苗生长的影响

2．1．1对发芽率和发芽势的影响在人工老化处理的过程中，E＋和E－野大麦种子发芽率的变化呈先缓慢下降，后大幅度下降的趋势（图1A）。其中E＋种子的发芽率要高于E－种子，老化5，10，15和20min后E＋和E－种子的发芽率差异显著（P＜0．05），随老化时间的增长，发芽率在老化25min后大幅度下降，在35min时降到最低，且E＋种子和E－种子的发芽率差异不显著。随老化程度的加剧，发芽势呈现与发芽率相似的变化趋势（图1B）。老化5，10，15和20min后的E＋种子的发芽势要显著高于E－种子（P＜0．05），且E＋种子上升和下降的幅度要小于E－种子。

2．1．2对苗长、根长的影响种子发芽12天后，野大麦的苗长和根长随着老化时间的增加而呈逐渐下降趋势，其中E＋的苗长和根长始终大于E－。在老化5，10，15和20min后E＋的胚芽长显著长于E－（P＜0．05），在老化5，10，15和25min后E＋的胚根长与E－差异显著（P＜0．05）。

2．1．3对活力指数的影响随人工老化程度的加剧，种子的活力指数先急剧下降后缓慢下降，E＋种子的活力要始终大于E－种子，其中老化0，5，10，15，20，25min后，E＋种子的活力要明显高于E－（P＜0．05），而老化处理30，35min后，E＋和E－种子的活力指数没有显著差异，在35min后E－种子的活力基本丧失，活力指数为9．6（图2）。

2．2内生真菌对野大麦种子生理指标的影响

2．2．1种子浸出液电导率电导率测定的结果显示，随着老化时间的延长，种子的电导率逐渐增加，在老化35min后达到最高，且E＋始终低于E－。在老化5，10，15，20min后E＋与E－之间差异显著（P＜0．05），其他处理时间，E＋和E－之间差异不显著（图3）。

2．2．2种子浸出液可溶性糖含量在人工老化处理过程中，由于种子的膜透性发生改变，浸出液可溶性糖的含量随老化时间的延长呈增加趋势，其中E＋的含量要低于E－，且E＋变化幅度要大于E－。在老化0，5，10，15和20min后，E＋要明显低于E－（P＜0．05），而其他处理时间下两者差异不显著（图4）。

2．3野大麦种子生理指标与活力指标的相关性分析对野大麦种子的浸出液电导率和可溶性糖与种子的发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数进行相关性分析，结果如表2所示。对野大麦种子浸出液电导率和可溶性糖与种子的发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数的相关分析可知：电导率和可溶性糖与种子活力指标之间呈显著负相关（表2）（P＜0．01）。

3讨论

禾草内生真菌主要靠种子进行传播［4］，本研究通过控制不同老化时间来观察野大麦种子各生理生化指标，比较被内生真菌侵染（E＋）的野大麦种子和未被侵染（E－）种子各生理生活指标的不同，表明内生真菌在种子老化情况下对其贮存、生长的促进作用。种子活力与种子的贮藏、劣变、萌发等过程有着密切的联系［21］，人工老化处理野大麦的种子，其发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长以及活力指数随着老化程度的加剧而逐渐降低［22］，对于人工老化时间相同的种子，被内生真菌侵染的（E＋）野大麦种子各生理指标要明显高于未被侵染的（E－），且变化幅度也小于未被侵染的（E－），由此可见内生真菌的存在为种子的萌发等带来一定积极的影响。这与张兴旭对内生真菌与保存时间互作对醉马草（Ach－natheruminebrians）种子的生理影响研究结果类似，在不同处理时间下内生真菌可以显著促进种子的萌发［23］。随着人工老化时间的增加，种子的带菌率逐渐降低，种子的活力指标也相应降低，以25min为指标变化的拐点，当种子的内生真菌基本失活后，内生真菌对种子的活力也失去了影响。人工老化与自然老化条件下种子的生理生化会产生相似的结果，都会表现出种子发芽率、发芽指数等活力指标的降低，以及种子可溶性糖泄露的增加［24］。国内外研究表明，种子劣变期间发生的最主要的生理变化是质膜受损，受损后膜的透性便增强，细胞内的电解质和代谢物的渗透量增大［25］，大量可溶性营养物质与蛋白质、糖、无机离子、氨基酸等渗漏出去［26］，同时还会释放特定的气体，使种子浸出液的导电性增强［27］，因此电导率和可溶性糖可作为测定种子活力的方法。本研究表明，在（58±1）℃热水中进行种子老化，浸出液电导率和可溶性糖含量随着老化时间的加长而增加。说明随着老化处理时间的延长种子劣变加剧，细胞质膜的受损程度变大，种子内溶物透过膜外渗增加。但在有些禾本科种子老化的过程中，电导率与活力指标并无相关性。如王彦荣等对苏丹草（Sorghumsudanense（piper）stafp）和老芒麦（ElymusSibiricus）等禾本科种子劣变研究过程中发现电导率与生活力无相关性［25］，这可能是由于种子结构、化学组成不同所引起的。试验结果中种子浸出液的电导率和可溶性糖含量与种子各活力指标之间呈负相关，并且达到了极显著水平。说明浸出液电导率和可溶性糖含量可作为评价野大麦种子活力的适宜指标。且本研究中被内生真菌侵染的野大麦种子电导率和可溶性糖的变化幅度要小于未被侵染的种子，表明内生真菌在一定程度上减缓了质膜的损伤程度，降低了膜的通透性，但随着老化时间的加长，当内生真菌基本失活后，浸出液的电导率和可溶性糖含量与未被内生真菌侵染的种子基本相同。

4结论

在人工老化过程中，种子的发芽率、发芽势和活力指数随老化时间增加而降低；胚芽长和胚根长也随老化时间的增加而减少；浸出液的电导率和可溶性糖含量随老化时间的增加而增加，且与发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数呈极显著负相关（P＜0．01），但被内生真菌侵染的种子明显减缓了种子老化生理反应变化的幅度。研究认为，与未被内生真菌侵染的种子相比，内生真菌可促进野大麦的发芽率，促进芽长根长的生长，降低膜的损伤，减少浸出液电导率和可溶性糖的含量，从而降低种子的劣变程度，延长种子贮藏时限。

作者：赵晓静 李秀璋 王萍 李春杰 单位：草地农业系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院