荧光定量PCR技术在草莓上的应用范文

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《北京农学院学报》2016年第3期

摘要:

【目的】为优化荧光定量pcr技术体系并在草莓研究中应用.【方法】以二倍体草莓为试材,草莓当中两个βG肌动蛋白基因家族成员Actin1和Actin2为内参基因,对比分析10μL和20μL反应体系条件下荧光定量PCR扩增反应.【结果】内参基因引物组合Actin1的扩增效率等指标优于AcGtin2;10μL反应体系中的扩增效率等指标优于20μL反应体系;内参基因Actin1在10μL反应体系下是草莓最优的荧光定量PCR技术体系.【结论】优化了草莓荧光定量PCR体系并应用该技术体系检测了草莓CrRLK1Ls家族成员的时空表达情况.

关键词:

荧光定量PCR;内参基因;草莓;扩增效率;CrRLK1Ls 

实时荧光定量PCR(RealGtimePCR)技术是在普通PCR反应中引入一种荧光化学物质,根据检测到的即时荧光信号代表特异性扩增产物的量,并据此计算初始模板的量,实现基因表达的定量检测[1].具有高灵敏度、高重复性、高安全性和高准确性等优点,广泛应用于临床疾病[2G6],食品安全[7]和动物试验[8,9]等领域,植物领域已在玉米[10]、观赏海棠[11]、葡萄[12]、紫苏[13]等植物上广泛应用.实现了普通PCR从定性到定量的飞跃.荧光定量PCR技术通常需要采用一些表达稳定的基因(内参基因)作为内部参照,去除不同处理在细胞数量、提取条件和上样过程等方面存在的误差.常用的内参基因有甘油醛G3G磷酸脱氢酶基因、βG肌动蛋白基因、β2G微球蛋白基因、18SrRNA基因等[14].但是,这些内参基因的表达量并不总是恒定不变的,在不同组织、发育阶段和反应条件下会有变化.因此,为了获得准确可信的基因表达量,在应用荧光定量PCR技术时需要从引物特异性、内参基因和反应条件稳定性等方面优化改进.Feronia家族是古老而又保守的CrRLK1Ls基因家族的亚家族[15],草莓中有7个成员.目前,植物中关于该家族的研究多集中在拟南芥中,在园艺植物中的研究相对较少,未见相关报道.本研究利用优化的实时荧光定量PCR技术分析Feronia家族7个成员的时空表达特征,为今后研究该家族调控草莓生长发育的分子机制奠定基础.

1材料与方法

1．1植物材料和仪器

以北京农学院组培中心栽培的二倍体草莓为试验材料,按照草莓果实不同发育时期,分为绿果、白果、片红和全红四个时期,每个时期测定15个果实样品,然后将样品随机分成3组,3个生物学重复;草莓不同组织取样,根取幼嫩的白根、茎取幼嫩的匍匐茎、叶取幼嫩的新叶、果取绿果期果实,每个组织设置3个生物学重复,液氮速冻植物材料并G80℃冰箱保存备用.主要仪器型号为LightCycler96荧光定量PCR仪(德国罗氏公司).

1．2总RNA提取和cDNA的合成

草莓不同组织和发育期(根、茎、叶,绿果、白果、片红果和红果)总RNA的提取按照OMEGA植物RNA提取试剂盒法,具体步骤:在液氮充分研磨样品,取100mg研磨好的样品转入1.5ml离心管,然后加入含1%βG巯基乙醇的裂解液500μL和PlanGtaid50μL,混匀,3~5min55℃水浴;然后离心10min,转速为12000g,转移上清液到一个新的离心管中;加入0.5体积的无水乙醇,立即上下翻转混匀;转移混合物至吸附柱中,室温环境中放置2min,离心30s,转速为12000g,弃掉废液;加500μL去蛋白液,室温环境中放置30s,离心30s,转速为12000g,弃掉废液;加700μL漂洗液,离心30s,转速为12000g,弃掉废液,重复本步骤;将吸附柱放回空收集管中,离心2min,转速为12000g,尽可能除去漂洗液,防止漂洗液残留乙醇抑制下游反应;将吸附柱放入一个RNasefree离心管中,加30~50μLRNasefreewater(事先在70G90℃水浴中预热),室温放置2min,12000g离心1min;收集到RNA放入－80℃保存备用.草莓不同组织总RNA反转成cDNA按照ReGverseTranscriptaseMGMLV(RNaseHG)试剂盒(TaKaGRa)进行,具体步骤:5μL纯化的总RNA与1μL的Oligo(dT)18Primer(50μmol/L)混合,70℃温浴10min,冰上2min,加入5×MGMLVBuffer,dNTPMixGture,RNaseInhibitor,RTaseMGMLV,用ddH2O水定容并混匀,总体积为20μL.反应条件为:先在42℃放置孵化1h,然后70℃温浴15min,最后在4℃冷却,反转录合成cDNA链,通过电泳检测,将反转录合格的cDNA保存于－20℃冰箱.

1．3内参基因引物设计和检测

以二倍体草莓研究常用的两个βG肌动蛋白基因(βGactin,ACTB)Actin1和Actin2作为内参基因,在NCBI上的登录号分别为XM_011471474.1和XM_004306544.2,用软件Primer5.0分别设计3对引物,分别从中选出最优的1对引物组合Actin1和AcGtin2,由上海生物工程公司合成.Actin1GF:GCGACAATGGAACTGGAATGG;Actin1GR:GACAATTTCCCGTTCAGCAGTG;Actin2GF:TGGGTTTGCTGGAGATGATG,AcGtin2GR:CAGTTAGGAGAACTGGGTGC.以绿果期cDNA为模板,普通PCR技术克隆两个内参基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳结果检测内参基因引物.普通PCR技术反应体系为:10×扩增buffer4μL,dNTP0.8μL,cDNA模板1μL,TaqDNA聚合酶0.2μL,Mg2+1μL,ddH2O3μL,退火温度54℃.阴性对照不加模板.

1．4实时荧光定量PCR反应体系的优化

荧光定量PCR采用SYBRpremixEXTaqTMreagent试剂盒(TaKaRa),按说明书进行.为确定最适的内参基因和反应体系,本试验设置4组实时荧光定量PCR反应.第一组:内参基因为Actin1,反应体系为10μL;第二组:内参基因为Actin1,反应体系为20μL;第三组:内参基因为Actin2,反应体系为10μL;第四组:内参基因为Actin2,反应体系为20μL.本试验的模板为绿果时期的cDNA,分别进行10倍梯度稀释(1、10倍、100倍、1000倍、10000倍)开展荧光定量反应,然后绘制标准曲线.具体反应体系见表1.实时荧光定量PCR反应程序为:95℃预变性3min;94℃变性20s,退火温度54℃,时间为20s,最后72℃延伸,时间为20s,共40次循环.每次循环第3步进行荧光信号采集,最后退火至65℃,每隔30s上升0.5℃,至95℃变性1min.检测其荧光值,绘制溶解曲线.qRTGPCR反应于德国罗氏LightCycler96荧光定量PCR仪上进行.cDNA标样和待测样均设置3次重复.

1．5草莓FERONIA家族时空表达

采用优化的实时荧光定量PCR的方法,检测Feronia基因家族成员在草莓根、茎、叶、果实等不同组织相对表达量,检测在绿果、白果、片红和红果等不同时期相对表达量,反应体系同上.数据采用SPSS13．0进行方差分析,Excel2007作图.

2结果与分析

2．1总RNA提取结果

高质量的RNA是实时荧光定量PCR基础,利用OMEGA植物RNA提取试剂盒法提取总RNA,用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA进行完整性检测,在紫外成像系统上拍照分析,电泳结果如图1所示,在28S和18S处呈现2条明亮的带,无明显脱尾现象,表明提取的总RNA完整性好,纯度高.用NanoDrop2000超微量分光光度计进行纯度和浓度检测,如表2所示,草莓不同组织和发育阶段总RNA浓度均在300μg/mL,OD260/OD280值在2左右.说明本试验提取的总RNA质量、纯度和产量均满足试验要求,几乎不存在多糖等杂质污染,反转后的cDNA可以做荧光定量PCR.

2．2内参基因引物

如图2所示,在退火温度为54℃的条件下,内参基因引物组合Actin1和Actin2分别在240bp和230bp扩增出单一明亮的条带,阴性对照显示无二聚体产生,说明两个内参基因均可应用于后续试验。内参基因Actin1目的条带亮度高于Actin2的亮度,初步说明Actin1扩增效率高于Actin2,可能更适用于荧光定量PCR.

2．3不同反应体系荧光定量PCR结果

本试验设置了4组不同的荧光定量PCR反应体系:Actin1G10μL体系、Actin1G20μL体系、AcGtin2G10μL体系和Actin2G20μL体系,4组不同的荧光定量PCR结果的扩增效率、回归系数和斜率数据见表3.可知4组反应体系处理的的扩增效率均在90％~102％之间,其中Actin1G10μL体系的扩增效率最接近100％,Actin1G10μL、Actin1G20μL、Actin2G20μL3组处理的回归系数均为0．998以上.说明Actin1G10μL是最优的反应体系,可以用于草莓基因的实时荧光定量PCR技术。

2．4FERONIA家族在不同组织中的表达

试验检测Feronia家族7个成员在草莓不同组织中的表达情况.实时定量PCR结果显示(图3),该家族7个成员在草莓根、茎、叶和果实中均能表达,并且在根和叶片中的表达量相对较多,可能在叶片和根组织中承担较多的功能.在拟南芥中的研究认为,Feronia能够促进根毛和叶片的生长[16,17]. 

2．5FERONIA家族成员在不同发育时期的发表

本试验检测Feronia家族在草莓果实不同发育时期的表达情况.RealGtimePCR结果显示(图4),Feronia亚家族在果实发育绿、白、片红和全红四个时期均有表达,表达量随着果实发育而降低,尤其是果实发育前期降低明显.这说明,该基因对果实发育可能有负调控作用,在拟南芥中的研究认为,FerGonia能够抑制授粉期间花粉管的生长[18].

3讨论

不同植物、组织和不同发育期适合做内参基因的候选基因是不同的,要获得高质量的实时荧光定量PCR数据的关键步骤就是确定稳定高效的内参基因.本试验对比研究了草莓中常用的两个βG肌动蛋白(βGactin,ACTB)家族成员作为内参基因,经过筛选,均无引物二聚体,特异性强,Actin1作为内参基因特异性好和扩增效率高,是适合的草莓内参基因.荧光定量PCR费用昂贵,为降低试验成本,试验将常规的20μL反应体系减少至10μL,扩增效率保持在90％~102％之间,标曲的斜率都保持在G3~G3．5之间,尤其是Actin1G10μL反应体系的扩增效率为101．5％,比较研究发现,10μL反应体系的荧光定量PCR反应扩增效率均高于20μL反应体系.同时,荧光定量PCR反应体系的引物浓度影响试验结果,如果引物浓度太低,使PCR反应不完全,若引物浓度太高,则增加发生错配以及产生非特异的产物的几率.这说明Actin1G10μL反应体系是草莓荧光定量PCR优化的理想体系.草莓Feronia家族功能的研究主要集中在拟南芥中,在果树上的研究未见相关报道.其在拟南芥中的功能研究主要集中在两个方面,一个方面是该蛋白家族膜外Malectin结构域作为受体与配基的互作研究;一方面是膜内激酶结构域参与介导下游的信号转到作用,调控植物细胞的生长发育[16G19].2014年,Haruta等在SCIENCE杂志撰文,报道了FERONIA的膜外Malectin结构域作为受体与快速碱化因子RALF直接互作,使膜外的PH值升高,抑制细胞的生长.该文章通过FERONIA的突变体fer开展研究,主要表型是根毛生长受到抑制.2014年,Duan等在NatureCommunication也报道了团队的最新研究进展,详细研究了FERONIA通过尿苷酸交换因子GEF与ROSp相互作用,调控质膜活性氧的浓度变化,参与介导植物细胞的生长发育.研究发现,突变体fer花粉管表现出生长过度和不破裂,影响精细胞的释放,造成花粉受精失败.该课题组还开展了很多相关的研究,比如FERONIA与内源激素ABA的响应,与生长素IAA、与赤霉素GA,与油菜素内脂BR等的响应.总的来讲,该家族对植物的生长发育有两方面的影响,一方面是促进生长,表现在使子叶、子叶下胚轴、种子和气孔细胞生长变大;另一面是抑制生长,表现在抑制根毛的生长和花粉管的伸长等.该家族与激素的关系,一般认为,该家族的基因表达与生长素、细胞分裂素,赤霉素等正调控,与ABA等负调控.Feronia家族在草莓中的时空表达情况显示,该家族应该在草莓的生长发育过程中具有重要作用,尤其是对果实的发育.

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作者:张卿 邢宇 曹庆芹 秦岭 单位:北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室