抗生素抗性基因的水环境论文范文

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1抗生素抗性基因在水环境中的来源与污染情况

1.1地表水中的抗性基因污染随着人类社会的不断发展，畜牧养殖、污水处理等人类活动对于地表水中抗生素抗性基因污染的影响日益显著。虽然污水处理厂的处理工艺能够去除一部分抗性基因，但是仍有大量抗性基因随出水排入地表水中。近年来，研究人员在江河湖泊等地表水中检测出大量的抗生素抗性基因。Pruden等[22]检测出美国南拉普特河从上游至下游中(人类活动呈递增梯度)sul1抗性基因的含量大幅度增加，深入研究后发现sul1含量与上游河岸的动物养殖厂及污水处理厂数目成正相关。Chen等沿珠江流域至珠江河口(人类活动影响呈递减梯度分布)检测江水中的四环素类抗性基因(tetA、tetC、tetH、tetB、tetM、tetO、tetW抗性基因)的含量，发现珠江流域检测到四环素类抗性基因的频率与种类都明显高于珠江河口地区。Ling等在中国南方北江河中检测出2种磺胺类抗性基因和7种四环素类抗性基因，其中磺胺类抗性基因中sul1的含量比sul2高，其平均值分别为1.41×10-2和1.58×10-3copies•(16SrDNA)-1；四环素类抗性基因中tetG的出现频率最高(100%)，tetC的含量最高，其浓度在8.30×10-2到13.20copies•(16SrDNA)-1之间变化。Jiang等利用PCR技术在黄浦江中检测到2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)、8种四环素类抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetM、tetO、tetW、tetX)和1种内酰胺类抗性基因(TEM)，并利用实时定量PCR技术检测出这11种抗性基因的含量在3.66×101copy•mL-1(tetB)到1.62×105copy•mL-1(sul2)之间变化。Luo等在中国海河中也检测出磺胺类抗性基因和四环素类抗性基因，同样，磺胺类抗性基因的检测频率与含量都高于四环素类抗性基因。其中，sul1抗性基因含量为(7.8±1.0)×109copies•g-1，sul2抗性基因含量为(1.7±0.2)×1011copies•g-1。Stoll等在德国的莱茵河和澳大利亚的布里斯班河中均检测出多种抗生素抗性基因，磺胺类抗性基因的检测频率最高，其中sul1检测频率(98%)稍高于sul2(77%)。在水产养殖业中大量添加的抗生素，一部分不能被鱼类吸收而直接排入到水体中，另一部分被鱼类吸收后在其体内诱导出抗性菌株，随粪便排入水体，所以在水产养殖区水体中亦存在大量抗性基因。Gao等在天津地区的水产养殖场中检测出多种抗性基因(tetM、tetO、tetT、tetW、sul1及sul2)。此外，磺胺甲基恶唑抗性细菌占63.3%，四环素抗性细菌占57.1%，这说明有一部分细菌呈多重抗性。Liang等在鱼塘中的大肠杆菌菌群中发现其中91.5%的大肠杆菌都含有抗性基因，86.1%的大肠杆菌含有两种以上的抗性基因。DiCesare等在地中海沿岸的养鱼场中也发现了tetM、tetO、tetL、tetK、ermB、ermA和ermC等多种抗性基因，但该渔场并没有在饲料中添加任何抗生素，这说明该渔场中的抗性基因可能是由于海水养殖促进了抗性基因的水平转移。Reboucas等在巴西的一个养虾场中也发现了对氨苄青霉素和四环素均具有抗性的致病性弧菌。除此之外，在越南、泰国、韩国、印度、埃及等其他国家的水产养殖水域中也都检测到抗生素抗性基因。以上研究表明，全球地表水体中含有数目“可观”的抗生素抗性基因，其中四环素类抗性基因和磺胺类抗性基因尤其居多，这可能和相应抗生素的大量使用及其在环境中的残留有关。虽然环境中本来就存在抗生素抗性细菌，但是环境中抗性基因的急剧增加主要是由于人类大量使用抗生素而对环境造成了巨大的选择压力。总之，地表水体已经成为了环境中抗生素抗性基因的一个主要基因库。

1.2地下水中的抗性基因污染由于动物养殖场污水池及土壤中的抗性基因随着土壤的渗透作用使得地下水中也开始检测出抗性基因的存在。Koike等从2000—2003年连续3年分别在两个养猪场的周围打井检测其地下水中的四环素类抗性基因，发现地下水中含有7种四环素类抗性基因。通过对养殖场污水池和地下水中发现的抗性基因序列的比较分析，发现两者几乎一致，这说明地下水受到了养猪场污水池的影响，其抗性基因主要来自于污水池。近年来，地下水也已经成为了抗性基因的众多基因库之一。

2抗生素抗性基因在环境中的传播与潜在风险

从上述不同抗性基因的基因库来看，不难发现各个基因库之间各有联系，人类、动物与生态环境之间形成了一个循环(图1)，使得抗生素抗性基因在其中不断循环、积累。人类在广泛使用大量抗生素治疗疾病时，由于抗生素的选择性压力，使其在人的肠胃及尿道中诱导出含有抗性基因的细菌。此外，肠胃细菌之间、肠胃细菌与经过肠胃的细菌之间，抗性基因都能够进行水平转移，又进一步增加了人体内抗性基因的含量。相似的，为了提高家禽养殖业、牛羊畜牧业以及水产养殖业的出产率，人们在饲料中大肆加入抗生素，这在各种动物体内同样会诱导出相应的抗生素抗性基因。体内含有抗性基因的动物被加工成肉类食品或者奶制品后，其中的抗性基因通过食物链又可进入人类体内。研究发现，一些养殖场内的空气中也含有抗性基因或抗性细菌，当养殖场工作人员吸入养殖场内的空气时，抗性基因或抗性细菌就会随空气一起进入人体。此外，如果人与动物直接接触，动物体内的抗性基因或抗性细菌也能直接进入人体。随后，人与动物体内的抗性细菌与抗性基因随着排泄物一起进入自然环境中。一部分排泄物进入污水处理厂(同时进入污水处理厂的还有医疗废水)，污水处理厂是抗性基因传播的重要中转地，污水处理厂中的处理工艺只能去除一部分抗性细菌与抗性基因，但是大部分抗性细菌和抗性基因不能被去除，甚至某些污水厂出水中抗性基因含量高于污水厂进水，这些抗性基因都随污水厂出水排入自然水体中，增加了污水处理厂下游水体的抗性基因含量。另一部分排泄物被用作肥料进入土壤生态系统，使排泄物中抗性基因转移到土壤菌株之中。而污水厂出水部分回用灌溉农田以及污泥堆积施肥更增加了土壤生态系统中的抗性细菌与抗性基因的含量，土壤中的抗性基因能够水平转移到庄稼等农作物中，这些农作物被加工成为农产品后又通过食物链进入人类体内。由于降雨等原因产生的地表径流会使土壤中的抗性细菌和抗性基因进入到地表水体中，而土壤系统的渗透作用使得地下水中也含有数量“可观”的抗性基因。如果这些地表水体或者地下水体被用来作为饮用水水源，虽然给水处理工艺能灭活部分抗性细菌和抗性基因，但仍有大部分抗性基因会随饮用水进入人类体内。从抗性基因在环境中的循环传播过程不难看出，抗性基因会在人体内积少成多，增强了人体细胞的耐药性，对人体健康和生态安全构成巨大威胁。在美国，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的感染病每年的致死人数比艾滋病、帕金森症以及杀人犯的总和还要多。当致病菌获得多重抗性基因后，就既具有致病性又具有多重耐药性，对人体具有极大的危害。最典型的就是含有NDM-1基因的超级细菌，曾引起世界范围内的恐慌。所以，加紧研究去除环境中的抗生素抗性基因的处理方法成为当务之急。

3抗生素抗性基因的去除技术

虽然国内外关于抗生素抗性基因在环境中的来源与传播途径的研究很多，但是关于抗性基因的去除技术的研究却很少。近年来，随着抗性基因污染情况越来越严重，一些研究学者们也在探索污水与给水处理厂中不同处理工艺对抗生素抗性基因的去除效果，以期能以最佳的工艺组合方式去除最多的抗性基因。

3.1厌氧/好氧污泥消化处理工艺污水处理厂是抗生素抗性基因最主要的一个储库，所以污水处理厂的处理工艺将是去除抗生素抗性基因的关键所在。事实上，尽管污水处理厂出水中仍含有抗性细菌和抗生素抗性基因，但绝大多数(>99%)的抗性细菌及抗生素抗性基因存在于污泥沉积物中。近几年，研究发现污水处理厂中的污泥消化工艺对于降低污泥中抗生素抗性基因的含量有着良好的效果。Ghosh等研究了高温(50~60℃)和中温(35~37℃)两相厌氧消化系统对四环素类抗性基因的去除效果，发现高温厌氧系统对tetA、tetO、tetX有很好的去除效果，其中tetX的去除率分别达到了85%~99%，而tetA和tetO的去除率也有50%~80%;而在中温厌氧消化阶段对抗性基因的去除效果并不明显，tetA含量甚至出现了反弹。这一结果显示抗性基因的去除效果可能与操作温度有关。随后，Diehl等研究了不同温度(22、37、46、55℃)下厌氧或好氧消化对污泥中抗生素抗性基因的去除效果。在厌氧条件下，37、46、55℃下抗性基因显著减少，并且去除率随温度的上升而增大；而在好氧情况下(平均水力停留时间为4d)四环素类抗性基因的含量并没有明显降低。Ma等进一步比较了高温和中温厌氧系统对抗性基因的去除效果，结果显示高温厌氧系统在去除ermB、ermF、tetO、tetW等4种抗性基因的效果确实优于中温厌氧系统，但是对于其他抗性基因的去除效果，高温厌氧系统并没有明显优势。Miller等也发现高温和中温厌氧消化系统都能降低sul1、sul2抗性基因和int1整合子的含量1到2个数量级，只是中温厌氧消化系统对tetO和tetW去除效果不理想。Ma等认为高温消化反应器之所以能够更有效地去除抗生素抗性基因，一方面是因为更高的温度有利于促进生化反应的进行，另一方面是因为高温消化系统中菌群组成结构与中温消化系统有所不同，而后者起决定作用。此外，污泥龄也影响抗性基因的去除效果，比较两种不同污泥龄的中温消化系统，污泥龄为20d的消化系统对抗性基因的去除效果明显好于污泥龄为10d的消化系统，这一结果与Xia等的结论相一致。虽然Diehl等在试验中认为好氧消化不能显著去除抗生素抗性基因，但Burch等认为Diehl等的试验设计不完整，因为试验中4d的平均水力停留时间过短，如果抗性基因的半衰期大于4d，即使好氧消化系统能有效去除抗生素抗性基因也无法检测。因此，Burch等设计试验的水力停留时间为40d，结果显示在半连续流条件下对ermB、sul1、tetA、tetW的去除率达到了85%~98%，但是int1含量却没有显著变化，而tetX含量增加了5倍，这可能是由于好氧消化系统对含有int1和tetX的细菌细胞具有选择性。因此，污水处理厂中的污泥消化工艺在降低抗生素抗性基因含量方面具有潜在的前景，耗氧量、温度、污泥龄及水力停留时间等都是影响其去除效果的重要因素，而怎样调整这些影响因素以达到最佳的去除效果在未来值得进行深入的研究。

3.2人工湿地处理工艺人工湿地是一种新型的污水处理设施，一般位于生物处理或者化学处理设备之后，用作二级或者三级处理，由于其工艺简单、经济、高效，适用于人口较少的小规模处理，现已被广泛应用于处理城镇污水。大量研究已经证明，人工湿地对污水中的有机物、细菌、抗生素、药物及个人护理品(PPCPs)均有较好的去除效果。但目前关于人工湿地对抗生素抗性基因的去除效果的研究还较少。Chen等调查了杭州及周边农村地区的污水处理厂，发现应用人工湿地能有效改善对抗性基因的去除效果，在多重厌氧生物过滤处理后添加一道人工湿地处理工艺能去除2个数量级左右的抗性基因，而仅应用多重厌氧生物过滤对抗性基因去除效果很小，这说明人工湿地在去除抗性基因方面具有重要作用。随后，Chen等比较了污水处理厂中生物曝气滤池、紫外消毒及人工湿地3种处理方式对抗性基因的去除效果，发现人工湿地的去除效果最好，能降低1到3个数量级的抗性基因，生物曝气滤池只能降低0.6到1.2个数量级的抗性基因，而紫外消毒后抗性基因基本没有变化。但是，Anderson等在对加拿大马尼托巴省某人工湿地调查后发现，出水中只有blaSHV抗性基因的含量有较大幅度的降低，而其他抗性基因含量几乎没有明显降低，这可能是由于人工湿地去除含有blaSHV基因的细菌较多，造成了对blaSHV基因的选择性去除。Nõlvak等也通过研究发现，水平潜流人工湿地对sul1抗性基因的去除效果尤为突出，而对其他抗性基因的去除效果与常规处理效果差不多。Liu等在研究火山岩滤料垂直流人工湿地和沸石滤料垂直流人工湿地对养猪场废水的处理效果时发现，火山岩滤料人工湿地对抗性基因含量的去除率为50%，而沸石滤料人工湿地能降低抗性基因含量一个数量级。这可能与两种滤料的孔径大小有关，沸石滤料的平均粒径(4.32nm)比火山岩滤料的平均粒径(10.78nm)小，更小的粒径有利于抗性基因的去除。Yang等在研究不同类型人工湿地对抗性大肠杆菌及抗性基因的去除时发现，抗性基因的检测率从大到小依次为：基质≥出水>进水。其中，sul抗性基因在进水、出水及基质生物膜中的检测率分别为50%、61%和81%；tet抗性基因在进水、出水及基质生物膜中的检测率分别为67%、77%和76%。这可能是因为抗性基因能迁移到基质生物膜上，从而增加了膜上的抗性基因含量，而生物膜中的抗性基因迁移到水中又增加了出水中的抗性基因含量。但是，上述两位学者都认为人工湿地的处理效果与湿地中植物覆盖率、植物种类、水力负荷以及当地气候都有着紧密的联系，不同人工湿地对抗性基因的去除效果也不一样。以上研究说明人工湿地对去除抗性基因可能具有某种选择性。因此，对于人工湿地的实际应用，应针对不同的抗性基因采用不同的填料或不同类型的人工湿地，做到“对症下药”。

3.3消毒处理工艺不论在给水还是污水处理工艺中，消毒工艺都是非常重要的一步。现有的消毒工艺主要有自由性氯消毒(加氯消毒)、氯胺消毒、臭氧消毒及紫外辐射消毒。在众多消毒工艺中，应用最广泛的是加氯消毒和紫外消毒。虽然消毒工艺能有效灭活水中的细菌微生物，但是关于消毒工艺能否有效地去除水体中的抗生素抗性基因的研究还较少。

3.3.1加氯消毒工艺加氯消毒的机理如图2所示，氯气作为一种氧化剂，能氧化细菌细胞，改变细胞膜的渗透性，从而进入细胞内破坏细胞质，最终分解RNA和DNA。而游离性有效氯对胞外被膜中的大部分物质的反应活性为中等水平，只是对脂类和糖类反应活性很低。所以，一般氯会在细胞壁与细胞膜中消耗一部分，剩余部分进入细胞质，并氧化胞内DNA，使其失活。最早，Venkobachar等发现用氯氧化大肠杆菌时，当加氯量为1.5mg•L-1时，能在上清液中检测出蛋白质和RNA；当添加量增加时，能在上清液中检测出DNA。Suquet等发现在50mmol•L-1、pH为7.4的磷酸缓冲溶液中，当加氯消毒CT值大于180mg•L-1•min-1时，溶液中出现大量DNA碎片。由此可见，在游离性有效氯消毒过程中，只有当加氯量较高时才能破坏分解大量DNA。在实际应用中，经加氯消毒处理后，Munir等发现抗性基因的含量并没有显著减少，Gao等也发现污水处理厂中加氯消毒并不能有效减少tet和sul类抗性基因的含量。此外，还有研究发现，较高剂量的加氯消毒能增加四环素类抗性细菌的抗药性，因为高剂量的氯消毒对抗性细菌产生了“筛选”作用。

3.3.2紫外消毒工艺与加氯消毒不同，紫外辐射消毒是个物理过程，通过光化学反应灭活细胞。从细胞内物质对其反应活性看，只有嘌呤和嘧啶核苷基、核苷酸吸收253.7nm波长的紫外光，所以，紫外光的专一性使其具有潜在的有效灭活抗性基因的可能。早先，Munakata等就发现紫外辐射能够破坏双链DNA中抗性基因的转换能力，从而降低了抗性基因的水平转移风险。Guo等研究结果显示，在污水处理厂的污水中，红霉素类抗性基因和四环素类抗性基因的含量分别为(3.6±0.2)×105和(2.5±0.1)×105copies•L-1，经5mJ•cm-2剂量的紫外消毒后，红霉素类和四环素类抗性基因含量分别降低了(3.0±0.1)和(1.9±0.1)个数量级；此外，还发现经紫外消毒后两类抗生素抗性菌的数量出现显著降低，然而四环素类抗性细菌占细菌总数的比例却有所增加，由此说明紫外消毒对四环素类抗性基因具有一定的选择作用。McKinney等用紫外消毒处理4种抗性基因(mecA、vanA、tetA、ampC)后发现紫外辐射确实能够降低抗性基因的含量，但灭活抗性基因3到4个数量级所需的紫外剂量为200~400mJ•cm-2，远远大于灭活抗性细菌所需要的紫外剂量(灭活4到5个数量级的抗性细菌，需要紫外剂量为10~20mJ•cm-2)。VanAken等也在试验中发现，使用紫外辐射处理大肠杆菌细胞悬浮液，DNA含量降低2个数量级所需要的紫外剂量为23mJ•cm-2，远大于灭活大肠杆菌细胞所需的剂量(8.7mJ•cm-2)。综上所述，紫外消毒工艺能有效降低抗生素抗性基因的含量，但是所需的紫外剂量较高，远超过实际应用的剂量。在实际应用中，Auerbach等发现紫外消毒对减少污水中四环素类抗性基因的种类以及降低tetQ、tetG的含量都没有明显的效果。因此，寻求更有效的方法是当务之急。近年来，有研究发现添加TiO2纳米颗粒与近紫外光复合使用能提高其去除抗性基因的效率，使得紫外消毒处理抗性基因与处理抗性细菌所需消毒剂量相当，Li等也发现加入Ag-TiO2复合纳米材料能大大提升紫外光消毒的效果。这给未来研究有效去除抗性基因的消毒工艺提供了方向。

3.4深度处理工艺随着饮用水工艺的不断发展，以及人们对饮用水要求的不断提高，现今污水/给水处理厂中除了常规处理工艺之外，还应用了许多水深度处理工艺。目前，研究较多的水深度处理工艺主要有膜处理、高级氧化等。Öncü等发现，用TiO2光催化氧化和臭氧氧化处理12.8和6.4μg•mL-1两种浓度的质粒DNA均有显著的效果，其可以破坏DNA的超螺旋结构，从而灭活DNA。试验中发现质粒DNA的浓度随臭氧氧化剂量的增加而减少，对于高浓度质粒DNA溶液，当臭氧剂量为4.2mg•L-1时质粒DNA浓度最低；对于低浓度质粒DNA溶液，当臭氧剂量为0.9mg•L-1时超螺旋DNA双链已完全消失。TiO2光催化氧化效果与臭氧氧化效果类似，高浓度质粒DNA溶液在经过75min的TiO2光催化降解后，超螺旋DNA双链全部消失；而对于低浓度的质粒DNA溶液，TiO2光催化降解只需15min就可以将其中的所有超螺旋DNA双链破坏掉。Cengiz等应用芬顿试剂高级氧化工艺和臭氧氧化工艺去除养牛场废水中的tetM抗性基因，发现两种工艺中抗性基因的变化趋势一致，即抗性基因的含量随着氧化剂剂量的增加而减小，当芬顿试剂添加量达到40mmol•L-1H2O2/4mmol•L-1Fe2+时去除效果最好。除了高级氧化工艺之外，膜处理工艺对抗生素抗性基因也有很好的效果。Munir等比较了活性污泥法+氯消毒、氧化沟+紫外消毒、旋转生物接触氧化+氯消毒、膜生物反应器+紫外和活性污泥+紫外这5种不同处理工艺对抗性基因的去除效果，发现膜生物反应器对抗性基因的去除效果最好，能降低抗性基因的含量2.57~7.06个数量级。Breazeal等研究了膜孔径从0.45μm到1000道尔顿的微滤/超滤膜对抗性基因的去除效果，发现微滤膜对抗性基因的去除效果不大，但是膜孔径为10万、1万、1千道尔顿的超滤膜分别能使抗生素抗性基因含量降低1.7、4.9、>5.9个数量级；试验还发现水中的胶体物质对超滤膜去除抗性基因有促进作用，并且膜孔径越小，这种促进作用越明显。总之，随着深度处理工艺应用的越发成熟，其在未来去除抗生素抗性基因的处理工艺中必定会占据一席之地。

4研究展望

目前，国内关于去除抗生素抗性基因方法的研究仍然很少，针对抗生素抗性基因的研究仍有很多问题亟待解决，主要包括：1)继续深入调查研究不同种类抗性基因在我国各个区域环境中的分布以及具体来源，并且定量分析各个区域的抗性基因污染水平。2)许多抗生素抗性基因常与一些可移动遗传元件相关联，而这些元件往往还携带大量其他种类的抗性基因，这使微生物具有多重抗性。因此需尽快开展对环境中多重抗性的污染水平、多重抗性基因种类及基因水平迁移规律的研究，评估其生态健康风险，为控制抗性基因污染提供理论依据。3)污水/给水处理厂是抗性基因的主要储库，也是去除抗性基因的关键。不同水处理工艺及其组合工艺对于抗性基因的去除效果，以及不同组合工艺在不同工况条件下抗生素抗性基因的迁移转化规律及去除机制亟待研究。

作者：文汉卿史俊寻昊邓慧萍单位：同济大学环境科学与工程学院