集约化水产养殖论文范文

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1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验装置膜生物反应器(MBR)处理水产养殖废水的工艺流程如图1所示。反应主体为圆柱形有机玻璃容器，有效体积为70L。膜组件为杭州捷滤膜分离技术有限公司生产的聚偏氟乙烯（PVDF）+特种纳米材料材质的中空纤维膜，截留孔径为0.1μm，中空纤维内径为0.9mm，中空纤维外径为1.5mm，膜面积为2m2，出水方式为负压抽吸。正常运行时反应器采用间歇运行，每隔6h抽2h水。出水时间和停抽时间8min和2min。水力停留时间为8h。

1.1.2培养基（1）牛肉膏蛋白胨硝酸盐固体培养基：5g牛肉浸膏，10g蛋白胨，1gKNO3，20g琼脂，1000mL自来水，pH7.2～7.4。（2）硝酸盐葡萄糖反硝化培养基：5g葡萄糖，2gKNO3，1gK2HPO4，1gKH2PO4，0.20gMgSO4•7H2O，1000mL蒸馏水，pH7.2～7.5。（3）DM培养基：4.70g琥珀酸，7.90gNa2HPO4•7H2O，1.00gKNO3，1.50gKH2PO4，0.30gNH4Cl，0.10gMgSO4•7H2O，2mL微量元素溶液。微量元素溶液：50gEDTA，2.20gZnSO4，5.06gMnC12•4H2O，5.50gCaC12，5gFeSO4•7H2O，1.10g（NH4）6Mo7O24•4H2O，1.61gCoC12•6H2O，1.57gCuSO4•5H2O，1000mL蒸馏水，pH7.0。

1.1.3检测试剂（1）格里斯试剂（GriessReagent）Ⅰ和Ⅱ：试剂Ⅰ：将0.5g的对氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）加到150mL的30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。试剂Ⅱ：将0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加到50mL蒸馏水中，煮沸后，缓慢加入150mL的20%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。（2）二苯胺试剂：溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入100mL浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。

1.2实验方法

1.2.1活性污泥的培养驯化实验所用的污泥为哈尔滨市文昌污水处理厂间歇曝气池的活性污泥，其MLVSS/MLSS为45%，SV为34%，MLSS为5296mg/L。在活性污泥中好氧反硝化菌的富集驯化是通过MBR装置驯化上述活性污泥。操作过程为瞬时进水（水产养殖废水添加营养液配制而成）、曝气、出水。曝气期间，监测DO的浓度，保持DO浓度在2mg/L,温度保持28~30℃，pH为7左右。进水COD值在250～350mg/L,氨氮值在20mg/L左右，MLSS值为350mg/L。好氧反硝化菌污泥的驯化富集过程采用的COD和氨氮浓度逐步提高的方法，最后达到COD800mg/L，氨氮70mg/L；曝气时间从开始每个周期（24h）曝气6h，逐步增加到8、12、18、24h，使系统逐渐适应，最后保持好氧状态。为了加强好氧反硝化菌的优势，每隔24h向培养液中加入适量5%硫酸铵溶液、5%硝酸钾溶液和5%亚硝酸钠溶液，培养60d。

1.2.2菌株的分离、纯化与筛选取膜生物反应器中驯化60d的活性污泥10mL，经过充分打碎，用无菌水制备稀释液，取稀释倍数10-2、10-3、10-4稀释液在牛肉膏蛋白胨硝酸盐固体培养基平板上涂布，于30℃培养48h。挑取形状各异的菌株纯化数次，获得36株菌株。将此36株菌株分别接种于装有5mL的以硝酸钾为氮源的反硝化培养基的试管中，反硝化培养基的试管中应放入一倒置杜氏发酵管，以检测气体的生成。试管置于30℃恒温箱中培养。培养14d后，各取培养液5滴于白色比色皿上，加入格利斯试剂Ⅰ和Ⅱ各2滴，只有F20、F21、F28三株菌接种的试管中培养液（分别记为F20培养液、F21培养液、F28培养液，下同）呈红色，说明培养液中的硝酸盐被还原成亚硝酸盐，这3株菌具有好氧反硝化作用。再分别取这3支试管中培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，F20培养液和F21培养液呈蓝色，而F28未变色。说明F20培养液和F21培养液中仍有硝酸盐未被转化，F28培养液中没有硝酸盐；F28培养液中反硝化进行程度比F20培养液、F21培养液中反硝化程度高，F28菌株好氧反硝化能力较强。从而筛选获得一株好氧反硝化能力较强的菌株F28。将菌株F28接种于硝酸盐葡萄糖反硝化培养基斜面上扩大培养备用。

1.2.3菌株的鉴定从硝酸盐葡萄糖反硝化斜面上挑取菌株F28，做平板划线培养。待长出菌落后,观察菌落的形状、颜色等特征。采用革兰染色,显微镜观察其个体形态。另外,进行硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、葡萄糖发酵试验、吲哚试验、乙酰甲基甲醇试验、甲基红试验、柠檬酸盐试验、产硫化氢试验、过氧化氢酶试验等生理生化鉴定。并同时进行16SrDNA基因序列分析。使用DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.BacterialDNAkit，购自美国Omega生物技术公司）提取F28菌株基因组DNA。对该菌的基因组DNA进行PCR扩增的引物采用27F：5''''-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3''''和1492R：5''''-GGTTACCTTGTTACGACTT-3''''。PCR反应体系(25μL)：2.5μL10×PCR缓冲液,3.5μLMgCl2，0.5μL模板DNA，0.5μLPF和PR，1μLdNTP，0.5μLTaqDNA聚合酶，16μL超纯水。PCR反应条件为：98℃5min；95℃35s，55℃35s，72℃1min，35个循环；72℃8min。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。测序由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果通过NCBI的BLAST检索程序与GenBank中已知16SrRNA序列进行同源性分析。通过MEGA5.05软件用NJ法构建系统发育树。

1.2.4菌株的反硝化性能实验从硝酸盐葡萄糖反硝化斜面上挑取菌株F28接种于DM液体培养基中，200r/min、37℃摇床中培养，测OD600值，在OD600值0.4左右，按1%(V/V)接种量接种于DM液体培养基中，200r/min下恒温振荡培养3d，每隔2h测定培养液OD600值、培养液中硝酸盐以确定菌株F28的生长情况和反硝化能力。

1.2.5菌株F28对水产养殖废水的净化效果采集集约化水产养殖车间水处理过滤装置中的混合液，充分搅拌后，静置，取上清液过滤，装过滤液2L于5L三角瓶中。以5%（V/V）的接种量接种于上述污水中。每隔1d取样测定培养液中COD、硝酸盐、氨氮含量。

1.3分析方法硝酸盐的测定用紫外分光光度法；氨氮的测定用纳氏分光光度法；OD600采用分光光度计在600nm波长下，以未接种的培养液为参比，测量菌液的吸光度。COD的测定采用重铬酸钾法。

2结果与讨论

2.1含好氧反硝化菌污泥的培养驯化经过60d的不断调试,曝气时间由开始的每个周期(24h)6h变为24h。活性污泥里的菌群以好氧菌为主。此时进水营养液的COD为800mg/L,氨氮为70mg/L左右。系统稳定，COD去除率在80%以上，氨氮的去除率在80%以上，总氮的出去除率在55%以上。驯化结果良好。

2.2菌种鉴定菌落呈圆形,乳白色，表面光滑。生理生化检测表明，菌株F28革兰氏染色反应呈阴性，硝酸盐还原试验、葡萄糖发酵试验、柠檬酸盐试验、产硫化氢试验、过氧化氢酶试验呈阳性，淀粉水解试验、吲哚试验、乙酰甲基甲醇试验、甲基红试验呈阴性。经过对菌株F28菌株DNA的提取及PCR扩增，得到了一定长度的DN段，16SrRNA的PCR扩增产物电泳照片见图2。通过与左侧的Marker对照，可知目标扩增产物的片段长度约1500bp。对菌株F28的DNA进行测序研究，得到长度为1442bp的16SRNA基因序列，将获得的基因序列与GenBank数据库中序列比对，结果表明，菌株F28与多株假单胞菌属的菌株具有高度同源性，同源性均在99%以上,结合生理生化检测推断菌F28为Pseudomonassp。应用MEGA5.05软件采用NJ法构建系统发育树，确定其进化地位.结果如图3所示。

2.3菌株的反硝化作用菌株F28在DM液体培养基上培养生长时，溶液中硝酸盐浓度的变化曲线以及菌体生长变化曲线如图4所示。由图4可知，菌株F28延迟期内硝酸盐浓度有下降，但反硝化过程主要发生在对数期，对数生长期时间较长。在稳定期和衰亡期之后菌量不再增加，并在后期略有下降，但仍具有较强的反硝化能力。F28的延迟期较长，为7h。当菌种接种到新培养基之后，需要经过一段时间的调整和适应，以合成多种酶和细胞其它成分。F28的对数期相对较长，约持续9h，反硝化主要发生在这个时期，这可能是因为对数期生长速率最大，细胞合成所需要的能量和还原力主要在这一阶段被消耗，因此指数期是反硝化效率最高的时期。

2.4菌株F28对水产养殖废水的净化作用由表1可以看出，菌株F28对于集约化水产养殖废水处理2d后，NO3--N、NH4+-N浓度由初始77.1mg/L、46.3mg/L分别降至7.4mg/L、1.59mg/L，去除率分别为90.4%、96.6%。同时，菌株对废水中COD具有一定去除作用，处理2d后的去除率为33.7%。处理第3天基本上和第2天变化不大。因此，菌株F28在处理水产养殖废水处理中具有相当好的效果，在实际工程应用中具有较大潜力。本研究针对MBR反应器处理水产养殖废水系统，逐步提高反应器COD和氨氮的负荷，逐步增加活性污泥曝气时间以至全时段曝气，反应器内菌群以好氧菌为主，污泥驯化结果良好，系统稳定，MBR反应器的总氮的去除率在55%以上。经过稀释、平板划线分离纯化与筛选，从MBR处理水产养殖废水体系中获得的适合水产养殖废水处理的好氧反硝化菌F28。结合生理生化试验和16SrRNA基因序列分析及同源性对比确定所筛得的菌株F28为一株假单胞菌（Pseudomonassp）。好氧反硝化细菌广泛存在于自然生态系统中，目前分离出的好氧反硝化菌归属于多个属，假单胞菌是主要的属之一。从土壤、城市污水处理厂污泥中分离好氧反硝化菌常见报道。但适用于水产养殖系统的好养反硝化菌报道不多，李卫芬等从草鱼养殖池水中分离出一株高效好氧反硝化作用的施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri），杨小龙等从富营养化的鱼塘中分离出一株好养反消菌鉴定为不动杆菌属(Acinetobactersp)。分离好氧反硝化菌的常规方法是根据Takaya等建立的有氧反硝化菌平板分离法。有氧反硝化菌平板分离方法是基于溴百里酚（BTB）培养基的指示剂溴百里酚蓝在pH大于7.6时呈蓝色，而细菌的反硝化过程伴随着产碱，当平板培养基内有反硝化菌生长时，pH升高，菌落呈现蓝色晕圈或者出现蓝色。

全向春、李卫芬、杨小龙和姜磊等是基于有氧反硝化菌平板分离法进行好氧反硝化菌分离实验。本实验采用一种不同的高效分离好氧反硝化细菌方法。先使用牛肉膏蛋白胨固体培养基平板划线法，将驯化良好MBR反应器中的活性污泥可分离细菌分离出来，分别接种于内置有杜氏发酵管的DM液体培养基中。培养12d后，用格里斯试剂溶液Ⅰ和Ⅱ检测培养液中是否有亚硝酸盐产生和观察杜氏发酵管中气泡的产生以及培养液变浑浊情况，用二苯胺试剂检测培养液中硝酸盐消耗情况。Takaya等建立的有氧反硝化菌平板分离方法，是间接利用碱指示剂筛选出好氧反硝化菌。与有氧反硝化菌平板分离法本实验直接使用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ检测有无亚硝酸盐生成以及用二苯胺试剂检测硝酸盐更科学合理、准确度更高，且周期短，操作性强。对菌株F28反硝化作用研究，显示其反硝化作用主要发生在细菌的对数生长期，随着细菌快速增殖，硝酸盐氮迅速下降，验证了李卫芬等报道的，好氧反硝化菌反硝化特性主要发生在对数期。菌株F28对水产养殖废水处理结果表明，24h时反硝化率去除率在70%以上；48h菌株对于水产养殖废水中硝酸盐、氨氮去除效果明显，去除率均在90%以上，同时碳的去除率达到30%以上。文献报道的适用于废水处理系统的好氧反硝化菌对氮去除率达到82%，菌株F28对氮的去除效率更高，适用于水产养殖废水处理。本研究分离出的适用于水产养殖废水处理系统的好氧反硝化细菌F28，对氮有良好的去除作用，同时对碳有一定的去除作用。集约化水产养殖用水量较大，养殖废水水质恶劣，利用生物方法处理水产养殖废水循环利用是降低养殖成本、控制环境条件、保护生态环境的有效途径。水产养殖废水中氮含量对养殖对象具有较大毒害作用，研究工艺中好氧反硝化菌对于水产养殖废水处理具有重要意义。菌株F28在水产养殖废水处理特别是集约化水产养殖废水处理实际工程应用中具有实际潜力与价值。

3结论

（1）利用MBR反应器，逐步提高反应器COD和氨氮的负荷，逐步增加活性污泥曝气时间以至全时段曝气，反应器内菌群以好氧菌为主，污泥驯化结果良好，系统稳定，MBR反应器的总氮的去除率在55%以上。（2）经过稀释、平板划线分离纯化与筛选获得了一株好氧反硝化菌F28，菌落呈圆形,乳白色，表面光滑。通过生理生化特性及16SrRNA基因序列分析及同源性比对，将菌株F28鉴定为假单胞菌中的Pseudomonassp。（3）研究菌株F28的硝酸盐降解及生长曲线规律发现，菌株F28能够有效去除硝酸盐，24h时反硝化率去除率在70%以上。菌株F28的延迟期较长，说明该菌株适应新环境能力不强。同时其对数生长期较长，说明该菌在生长阶段具有较强的反硝化能力的作用时间较长，硝酸盐浓度在对数期大幅度降低。（4）菌株F28对于水产养殖废水中硝酸盐、氨氮有较好去除效果，在水产养殖废水处理实际工程应用中有着积极的意义。

作者：郝兵兵罗亮战培荣位莹莹姜再胜杨洪波单位：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所上海海洋大学海洋科学学院上海海洋大学水产与生命学院