成虾流行疾病的病因探析范文

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作者：徐洋沈锦玉姚嘉赟潘晓艺郝贵杰尹文林杨国梁王军毅单位：浙江省淡水水产研究所浙江湖州

人工感染试验

将供试菌株接种于TSB培养液，28℃恒温培养24h后，用生理盐水将菌液分别稀释至108、107、106、105CFU/mL，每个稀释度注射3个试验组，每个试验组选取30尾体长为10cm的健康罗氏沼虾成虾，在靠近尾扇第3腹节处注射菌液，对照组注射生理盐水，注射量为0.15mL/尾。养殖用水为健康虾塘水，水温(26±2)℃，记录每天成虾的死亡情况。

主要致病菌的鉴定

1形态观察

观察致病菌的菌落形态，亚甲蓝染色观察细菌的形态，革兰氏染色进行鉴别试验。

2生理生化特性测定

根据革兰氏染色的结果选取相应的细菌生化鉴定管进行生理生化试验，参照细菌生化鉴定编码册判定结果。

3PCR鉴定

参照文献的方法，设计针对细菌16SrRNA基因的特异性引物进行PCR扩增。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列为P15''''-AGGTTGATGCCTAATACGTA-3''''和P25''''-CGTGCTG-GCAACAAAGGACAG-3''''。用试剂盒提取细菌的DNA作为模板，PCR反应体积为50μL，包括:Buffer(含MgCl2)5μL;DNTP(10mmol/L)4μL;ddH2O38μL;引物(10μmol/L)各1μL;Taq酶0.5μL;细菌模板0.5μL。反应条件:95℃预变性3min，94℃变性40s，51℃退火40s，72℃延伸90s，共进行35个循环，最后在72℃继续延伸8min，将产物送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。1.7药物敏感性试验取适量的细菌培养液均匀涂布于TSA培养基上，贴上药敏试纸，恒温28℃培养24h后测量抑菌圈直径，并根据抑菌圈直径和各种抗菌药物的具体标准判定其是否敏感。

结果

1流行病学调查结果

初步统计2009—2010年长三角地区罗氏沼虾成虾的主要疾病为三大类:肌肉白浊病:具体症状为体色发白，特别是尾扇部有白色斑点(以上海崇明和浙江嘉兴病样为主);蓝体病:具体症状为食欲减退，行动迟缓，全身均为深蓝色，肌肉也呈淡蓝色(以江苏高邮病样为主);红体病:具体症状为躯体与附肢变红，腮部变黄且出现大水泡，眼睛凹陷或脱落(以浙江湖州病样为主)。

2电镜观察

病样电镜观察未发现明显的病毒样颗粒。

3病样与病原菌的分类

用细菌学方法从病样的血液和肝胰腺中分离到优势菌11株，并对11株优势菌进行命名，结合2.1中三类不同的患病症状，将所得优势菌进行分类，结果见表1。

4主要致病菌的筛选

根据11株优势菌人工感染试验结果(表2)，结合三类不同的患病症状，筛选出死亡率最高的3株细菌，分别为SHB1、GYB8、HZL2。这3株细菌人工感染的病虾症状与其分离的病症相似，且将人工感染的病虾进行细菌分离能复制出原始的菌落形态与细菌形态，因此判断SHB1、GYB8、HZL2为主要致病菌。

5主要致病菌的鉴定

菌落形态观察

SHB1在TSA培养基上为灰白色圆形菌落，边缘光滑、中央凸起，细菌形态为短杆状(图1)，革兰氏染色呈红色，初步判断为革兰氏阴性菌;GYB8在TSA培养基上为半透明的突起圆形小菌落，细菌形态为直杆状(图2)，革兰氏染色为红色，初步判断为肠杆菌科;HZL2在TSA培养基上为白色大菌落，不规则形态呈片状生长，有迁徙生长的特性，细菌形态为两端钝圆的小杆菌(图3)，且革兰氏染色为红色，初步判断为变形杆菌属。

生理生化特性测定

根据形态染色的结果，参照相应细菌生化鉴定编码册进行生理生化试验，具体结果见表3。结果表明:SHB1、GYB8和HZL2依次为气单胞菌属(Aeromonas)、费氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreun-dii)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)。

PCR鉴定

PCR扩增得到与预期大小相符的DN段(图4)，其中SHB1的PCR产物共测出1066bp的序列，与嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)N2株同源性最高，为100%，因此可确定该细菌为嗜水气单胞菌;GYB8的PCR产物共测出1457bp的序列，与费氏柠檬酸杆菌HPG143株同源性最高，为100%，因此可确定该细菌为费氏柠檬酸杆菌;HZL2的PCR产物共测出1175bp的序列，与普通变形杆菌SBP10株同源性最高，为95%，因此可确定该细菌为普通变形杆菌。3株主要致病菌的序列结果见图5－7。

6药物敏感性试验

对SHB1、GYB8和HZL2进行常用抗生素的药物敏感试验，结果见表4。结果表明3株主要致病菌对环丙沙星和恩诺沙星高度敏感。

讨论

本研究初步统计2009—2010年长三角地区罗氏沼虾成虾的主要疾病为三大类:肌肉白浊病、蓝体病和红体病，且三类疾病有明显的地域性。目前国内梁森汉等对病虾进行了病原分离和回归感染等试验，认为细菌是罗氏沼虾肌肉白浊病的病原;姜兰等从患白浊病的罗氏沼虾虾苗病灶分离到多株菌株，其中一株经人工感染证实为病原菌，经自动细菌鉴定仪测试为木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus);笔者通过病原鉴定发现本次采集到的肌肉白浊病病样的主要致病菌是嗜水气单胞菌，由嗜水气单胞菌引发的水生动物暴发性疾病屡屡发生，但目前甚少见到嗜水气单胞菌引起罗氏沼虾成虾死亡。蓝体病目前在国内外极少见相关报道，该病症在江苏高邮地区极为普遍，其主要致病菌是费氏柠檬酸杆菌，该病症表现为肌肉呈淡蓝色，由于虾的血液为蓝色，考虑费氏柠檬酸杆菌是否存在使血液凝集的致病因子。费氏柠檬酸杆菌导致水产动物患病死亡的病例较少，李华等首次报道费氏柠檬酸杆菌是河蟹(Eriocheirsinensis)的致病菌，沈锦玉等研究认为，费氏柠檬酸杆菌是红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)的致病菌。红体病通常都爆发于仔虾中，有学者认为是一种由副溶血弧菌感染引起的细菌病，本研究发现其主要致病菌为普通变形杆菌，许兵等曾在对虾上分离到该病原菌，普通变形杆菌易引发的人类疾病，是人畜共患致病菌之一，因此需加强对该类疫病的检测，以防危害人类健康。

分离菌株的药物敏感性试验表明，3种主要致病菌对环丙沙星和恩诺沙星高度敏感，在生产上使用这两种药物也有一定的效果，但由于甲壳类动物构造及食性方面的特性［19］，一定程度上阻碍了药物的吸收，且普通变形杆菌等宿主范围较广，在许多生物中均可以感染，属于人畜共患致病菌之一，因此养殖场不能盲目用药，以免给整个水产养殖业造成更大的经济损失。因而，切断疾病的传染源、保持养殖环境的稳定性、提高虾的抗病力，才有利于防治虾病发生。