PCR检测转基因水稻成分范文

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水稻是占全世界50%人口的主粮，自第1批水稻转基因植株在1988年问世以来，许多国家在水稻转基因研究中取得一系列成果，许多转基因水稻育种材料已经进入田间试验，并不断向实用化方向发展。随着转基因产业的发展，转基因食品的安全性问题受到广泛关注，日本、欧盟等许多国家相继建立了转基因食品标识制度[1]。我国也于2002年3月20日起要求对5类转基因生物所涉及的17种转基因产品进行标识[2]。目前对转基因植物产品的检测方法主要分为两类：第1类以导入外源基因的特定DNA序列为检测对象的检测技术，第2类以导入外源基因表达的蛋白质为对象的鉴定方法[3]。由于基于外源基因的检测方法具有简便、快速、准确等特点，成为转基因作物检测的常用技术，包括常规pcr、巢式和半巢式PCR、RT-PCR(reversetranscriptionPCR)、PCR-ELISA技术等。Dietrich等[4]针对转基因水稻中的转基因成分，利用实时荧光定量PCR法进行了检测，检测灵敏度为0.1%。陈茹等[5]利用PCR-ELISA技术建立了检测转基因水稻的体系，比常规电泳检测可提高敏感性达1000倍。这些方法虽然对结果有更加准确的把握，但是操作过程复杂，检测成本较高，对操作人员要求较高。多重PCR是指在一次PCR反应中同时加入多对引物，同时扩增多个目的基因，只需要一次PCR反应，就能同时检测多个靶标基因，比传统PCR方法节约时间，减少费用，目前这项技术在动物病毒性传染病和人类疾病监测中应用较多。Ding等[6]通过对水稻、小麦、玉米等作物进行研究发现，蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)是水稻特有基因，可作为水稻内源基因。本研究在参考国标[7]中检测的一些常见外源抗虫基因的基础上，选取蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为内源参照基因，并选取花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂合成酶(NOS)终止子、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、苏云金芽胞杆菌Cry1Ab杀虫晶体蛋白基因(Cry1Ab)、Cry1Ab基因与Cry1Ac基因经人工拼接形成的基因(Cry1Ab/Ac)、Bt毒蛋白基因(Btc)这6个外源基因，对这7个基因拟建立七重PCR反应体系，为快速鉴定转基因水稻提供依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

转基因水稻、大豆、菜籽粕广东出入境检验检疫局；转基因棉花北京出入境检验检疫局；转基因玉米1中国农业大学；转基因玉米2(Bt176)和转基因玉米3(Bt11)上海交通大学；质粒PTF102(含GUS、NOS、CaMV35S基因)暨南大学生殖免疫研究所保存。WizardGenomicDNApurification试剂盒美国Promega公司；Taq聚合酶、dNTPs、10×PCRbuffer、MgCl2(25mmol/L)、100bpDNALadderMarker、6×LoadingBuffer、MultiplexPCRAssayKit大连宝生物工程有限公司；EB北京鼎国生物技术有限公司。ZN-02固体粉碎机北京新时利和科技发展有限公司；LG16-W型高速离心机北京医用离心机厂；NANODROP1000生物分光光度计美国ThermoFish-ers公司；PT-1148MJminiThermalCyle梯度PCR仪、Sub-CellGTBASIC型核酸电泳仪美国Bio-Rad公司；AmpGeneGel3000凝胶成像仪北京鼎永科技有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用暨南大学食品科学与工程系食品安全实验室建立的方法提取棉籽基因组DNA[8]，采用试剂盒法提取玉米、大米、菜籽粕基因组DNA，并用生物学分光光度计测定DNA的浓度和纯度。

1.2.2引物设计参照国标(行标、农标)的引物在NCBI中检索基因的原序列，利用PrimerPremierV5.0进行引物设计，再利用OligoV6.22对设计引物进行评估，筛选出引物之间相互干扰最小的引物组合，引物由上海生工生物技术有限公司合成(表1)。

1.2.3内源基因和外源转基因的单一PCR检测单一PCR反应体系包括：10×PCRbuffer5μL，dNTPmixture4μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，引物终浓度各0.4μmol/L，模板DNA2μL，Taq聚合酶0.25μL，ddH2O将体积调整为54μL。PCR反应条件为94℃预变性5min、94℃变性40s、60℃退火60s、72℃延伸60s，30循环；72℃延伸5min。取5μLPCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4多重PCR体系的建立与检测多重PCR反应体系包括：MultiplexPCRAssayKit中Mix1(含Buffer、dNTP、MgCl2)25μL，Mix2(含TaqTMDNA聚合酶)0.25μL，引物终浓度均为0.4μmol/L，模板DNA3μL(50ng/μL)，ddH2O将体积调整为50μL。PCR反应条件为94℃预变性1min、94℃变性30s、60.4℃退火90s、72℃延伸90s，35循环，72℃延伸10min。取PCR产物5μL于2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5PCR产物的序列测定PCR产物测序委托上海博尚生物技术有限公司完成，序列结果用NCBI-BLAST在线软件对其进行生物信息学分析。

2结果与分析

2.1DNA提取和转基因成分单一PCR验证及引物特异性验证使用经改进后的Promega试剂盒提取样品基因组DNA，经生物分光光度计检测，OD260/OD280的比值在1.7～1.9之间，符合要求。经单一PCR反应分别检测SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S，其结果均呈阳性(图1)。

2.2水稻七重PCR体系的建立在同一PCR体系中同时扩增7种基因(SPS内源基因、Btc基因、GUS报告基因、Cry1Ab/Ac抗虫基因、Cry1Ab抗虫基因、NOS终止子基因、CaMV35S启动子基因)，对PCR扩增体系中各个引物的浓度配比进行调整，并研究最佳退火温度。当引物终浓度配比为1:1:1:1:1:1:1时，退火温度为60.4℃时，7个基因的条带亮度较一致，多重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致(图1)。

2.3七重PCR扩增产物DNA序列测定七重PCR扩增产物委托上海博尚生物技术有限公司进行测序，测定结果在NCBI数据库进行BLAST对比分析。据分析可知，各个基因的PCR扩增产物(SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S)的DNA序列与已知序列的同源性分别为100%、99%、98%、100%、99%、99%、99%，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增片段。

2.4七重PCR体系检测已知转基因样品利用已经建立的水稻七重PCR体系来检测已有的转基因样品，结果如图2所示，泳道1有两条清晰条带，证明此菜籽粕样品中含有NOS、CaMV35S基因；泳道2有3条清晰条带，证明此棉花样品中含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S三种基因；泳道3有3条清晰条带，证明此玉米样品3中含有NOS、CaMV35S、Cry1Ab/Ac三种基因；泳道4有3条清晰条带，证明此玉米样品2中含有Cry1Ab、NOS、CaMV35S三种基因；泳道5有2条清晰条带，证明此大豆样品中含有NOS、CaMV35S二种基因，泳道6有6条清晰条带，证明此水稻样品中含有SPS、Cry1Ab、Btc、Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S六种基因。转基因大豆经检验检疫行业标准[9]采用荧光定性PCR验证含有NOS、CaMV35S；转基因玉米2(Bt176)品种经检验检疫行业标准[10]采用常规定性PCR验证含有Cry1Ab、NOS、CaMV35S基因；转基因玉米3(Bt11)品种经检验检疫行业标准[10]采用常规定性PCR验证含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因；转基因菜籽粕经检验检疫行业标准[9]采用荧光定性PCR验证含有NOS、CaMV35S；转基因棉花经检验检疫行业标准[11]采用常规定性PCR验证含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因；转基因水稻经广东出入境检验检疫局根据检验检疫行业标准[9]采用荧光定量PCR验证含有SPS、Cry1Ab、Btc、Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因。因而图2中的结果与检验检疫行业标准方法检测结果一致，证明建立的七重PCR检测系统具有较好的可靠性和准确性。

3讨论

本实验对转基因水稻中常见的7种基因建立了七重PCR体系，该体系只需1次PCR反应就能够检测出水稻中7种基因，大大提高了检测速度和准确性，并利用该体系也能够检测其他一些转基因作物如大豆、玉米等的转基因成分，对于快速检测转基因产品有着重要的实用价值。王小琦等[12]针对转基因水稻中常见的CaMV35S、NOS、Bt这3种转基因成分，建立了三重PCR体系。李伟丰等[13]针对转基因水稻中常见的CaMV35S、NOS、M.100bpLadderDNAMarker；1～7分别为SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S基因的单一PCR产物；8为上述7种基因的多重PCR产物。图1水稻转基因成分的单一PCR检测和多重PCR检测结果；1～6分别为上述建立的水稻七重PCR体系检测转基因菜籽粕、转基因棉花、转基因玉米3、转基因玉米2、转基因大豆、转基因水稻。图2七重PCR体系分别检测各已知转基因样品这6个基因，建立六重PCR体系。多重PCR有两个关键，第1个是扩展的产物片段大小不能太靠近，如果扩展的产物片段大小太靠近，将无法利用凝胶电泳分开，无法得出准确结论。第2个是各对引物之间不能产生二聚体，本研究采用Primer5.0的Multiplexprimer功能，进行多条引物的二聚体检验，为了保证扩增产物片段长度在重新设计引物时不至于太大的变化，检验不合格的引物重新直接在Oligo6.0进行左右移动设计(将发生二聚体反应的那一条引物进行左右几个碱基的移位，这样同时不影响产物片段的大小和另一条引物)。在设计引物时充分考虑了这两点，优先选择目前已经的标准和文献中的引物，Btc和Cry1Ab/Ac参考文献[14]，其中Cry1Ab/Ac在参考文献的基础上为了增加Tm值，增加了引物的长度，使Tm值在70℃左右；GUS基因的引物参考了文献[13]；Cry1Ab基因的引物参考文献[15]；NOS基因的引物参考了国标[16]；CaMV35S基因的引物参考了文献[17]；SPS基因的引物由本课题组自行设计并在NCBI中验证其特异性。

在研究中发现，水稻中含有少许PCR抑制物，会影响多重PCR反应结果，产物条带过暗或者不出，这种情况可以通过稀释提取的水稻DNA可以得到缓解。其原因可能是当稀释水稻基因组DNA时，抑制物也得到了相应的稀释，进而抑制物在多重PCR反应过程中的作用被削弱，使多重PCR反应能正常进行。研究还发现，水稻多重PCR产物较其他作物的多重PCR产物更容易降解，PCR反应完全后应尽快电泳，避免降解。在其他条件不变的情况下，镁离子浓度分别为2、2.5、3mmol/L时条带逐渐由暗变亮，增加镁离子浓度至3.5mmol/L时亮度基本不变，可以认为镁离子浓度为3mmol/L已满足此多重PCR体系的要求。