温度对Bt基因抗虫棉影响因素分析范文

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据统计，目前中国种植的转Bt基因抗虫棉面积已占植棉总面积的70％以上［1］。转基因抗虫棉的迅速发展，主要是由于其能有效地减轻棉铃虫等相关害虫的危害，减少农药用量。但国内外一致认为转Bt基因棉花的抗虫性表现不稳定。其中不良的环境对抗虫性表达具有较大的影响，即Bt棉在不良的环境条件下表现抗虫性显著下降或不抗虫现象［2－3］。棉花生育过程经常受高温胁迫的影响，而盛铃期又是棉花产量形成的主要时期，因此笔者通过研究棉花生育期高温对棉花铃壳中Bt蛋白表达的效应，并探讨与Bt蛋白的表达密切相关的氮代谢过程所受的影响，从而为Bt安全应用提供生理基础。

1材料和方法

1．1试验设计试验于2010－2011年在扬州大学江苏省遗传栽培生理重点实验室进行。以不同品种类型的棉花品种泗抗1号（常规棉）、泗抗3号（杂交棉）为供试材料，分别以SK－1和SK－3表示。棉花为盆栽，在盛铃期（8月15日），应用人工气候室设计出生产上可能出现的不同高温水平（34℃、36℃、38℃、40℃），相对湿度均设置为70％。选取长势相近的棉花植株，每个品种选10株，每个温度下2株，另外2株作为对照。在人工气候箱达到预定温度后，移入盆栽棉花样本，并开始计时，进行24h的高温逆境胁迫处理，胁迫24h后取样，同时对田间盆栽对照进行取样。每天保持盆中土壤含水量接近于田间持水量，定期浇水。肥料与化控运筹按当地高产栽培要求进行。2010年研究了盛铃期受高温胁迫24h后对bt蛋白表达的影响；2011年在2010年基础上又研究了盛铃期高温胁迫氮代谢的影响，以明确持续高温对Bt蛋白表达和氮代谢的影响。供试土壤为沙壤土，含有机质1．88％，水解氮134．7mg•kg－1，速效磷22．5mg•kg－1，速效钾81．3mg•kg－1。实验所用盆钵直径30cm，高27cm，每盆装土11kg，在大田中取的土壤经自然风干、过筛去杂后装盆，用水沉实。栽培方式为营养钵育苗移栽，播种日期是4月7日，幼苗在5月19日（播种后41d）移栽到大田，5月20日（播种后42d）移栽于盆中。

1．2取样方法于8月15日选取长势相近的棉花植株，对中部果枝1～2果节位，标记当日花，写好日期，挂牌于相应的果枝果节位，于花后10d进行高温胁迫处理，选取有相近果枝相同果节位的铃的棉株，放入人工气候室中进行高温逆境胁迫处理，每个品种选取10株，每个温度下2株，另外2株作为对照，在24h的高温逆境胁迫结束后，取事先标记过的棉铃，液氮速冻后放入超低温冰箱中保存。

1．3测定项目与方法

1．3．1Bt蛋白含量测定。称取一定量的铃壳鲜样，经提取液研磨提取一段时间后，离心取上清液备用。用酶联免疫法（Enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA）进行测定，药盒由中国农业大学提供。参见何钟佩所编《农作物化学控制实验指导》［4］。

1．3．2谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）含量测定。取样后的蕾和铃经液氮速冻后，称取的鲜样经Tris－HCl缓冲液研磨离心后，获得的提取液采用赖氏比色法进行测定［5］。

1．3．3游离氨基酸含量测定。将称取的鲜样研磨，过滤定容后，取提取液，应用茚三酮比色法进行测定［6］。

1．3．4叶片蛋白酶、肽酶活性、可溶性蛋白含量测定。参见文献［7］。1．4数据处理数据采用Excel2003和SPSSV13．0进行处理和统计分析。

2结果与分析

2．1高温胁迫对Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量的影响图1表明，盛铃期常规种泗抗1号在34℃、36℃、38℃和40℃高温水平胁迫24h条件下，10日铃铃壳中杀虫蛋白的表达量与相应对照（147．62ng•g－1）相比分别下降了3．75％，12．21％，33．43％和66．36％；杂交种泗抗3号的杀虫蛋白的表达量则与相应对照（153．55ng•g－1）相比分别下降了2．98％，10．71％，29．01％和57．93％。不同品种间相比，以常规种受高温胁迫后下降幅度较大。图1高温对10日铃铃壳中杀虫蛋白含量的影响

2．2高温胁迫对Bt棉花铃壳GPT活性的影响图2表明，常规种泗抗1号盛铃期在34℃、36℃、38℃和40℃高温水平胁迫24h条件下，10日铃铃壳中谷氨酸丙酮酸转氨酶活性与相应对照（11．93μmol•g－1•h－1）相比分别下降了7．05％，12．31％，35．7％和52．89％；杂交种泗抗3号的GPT活性则与相应对照（13．72μmol•g－1•h－1）相比分别下降了5．62％，11．32％，34．27％和48．01％。图2高温对10日铃铃壳中的GPT活性的影响

2．3高温胁迫对Bt棉花铃壳氨基酸和可溶性蛋白含量的影响图3表明，常规种泗抗1号、杂交种泗抗3号盛铃期在34℃、36℃、38℃和40℃高温水平胁迫24h条件下，10日铃铃壳中游离氨基酸含量比相应对照有所增加，如泗抗3号的游离氨基酸的含量分别比对照增加了10．14％，26．29％，78．38％和129．28％。并且在36℃以上胁迫条件下，2个材料的游离氨基酸含量均显著增加。图3高温对10日铃铃壳中的氨基酸含量的影响图4表明SK－1、SK－3盛铃期在34℃、36℃、38℃和40℃高温水平胁迫24h条件后，10日铃铃壳中的可溶性蛋白含量与各自对照相比均呈不同程度下降，并随着温度的增加，下降幅度加大，如泗抗3号在4个温度胁迫24h后，分别下降了2．90％，10．11％，24．8％和39．86％。

2．4高温胁迫对Bt棉花铃壳蛋白酶和肽酶活性的影响进一步研究高温胁迫下SK－1、SK－3棉铃中蛋白酶与肽酶活性变化（图5、图6）表明，在34℃、36℃、38℃和40℃高温水平胁迫24h后，2品种10日铃铃壳中蛋白酶、肽酶活性分别比各自对照有不同程度的增加，在36℃以上胁迫条件下，蛋白酶活性均显著上升。不同品种间相比，以常规种SK－1上升幅度较大。

3讨论

3．1高温影响Bt棉生殖器官杀虫蛋白的含量已有研究表明，高温影响Bt棉的抗虫性［8－9］。夏兰芹等人研究认为，温度变化会影响抗虫棉早期的生长和Bt杀虫基因的表达，从而影响Bt基因的沉默发生时间［10］，但前人研究仍集中在叶片方面。本文通过研究不同高温水平胁迫棉株24h对生殖器官抗虫性的影响表明：高温逆境条件盛铃期棉铃杀虫蛋白表达量有明显的下降，且随着温度水平的提高，下降的幅度也更大，并以在36℃以上时加剧下降。盛铃期铃壳中的杀虫蛋白表达量在38℃、40℃时的下降幅度明显高于36℃时的下降幅度，是它的2．7倍和5．4倍。推测36℃可能是棉花在高温逆境条件下杀虫蛋白含量表达的一个转折点，极有可能是棉花的高温临界点。因此，在大田生产中如果遇到持续超过该温度的高温，应增加农药用量，增强棉株抗虫能力。此外，杀虫蛋白表达量在品种间以常规Bt棉品种泗抗1号的下降幅度较大，说明盛铃期高温逆境会大幅度降低Bt蛋白的表达量，进而影响到棉花的抗虫性。说明杂交种的抗虫性受高温影响较小。

3．2高温影响Bt棉棉铃抗虫性，可能与高温降低蛋白质合成，促进蛋白质分解密切相关已有研究表明，Bt棉体内杀虫蛋白表达量与氮代谢水平呈显著以上水平正相关［11－13］。对高温胁迫下铃壳中氮代谢相关物质和关键酶研究进一步表明，铃壳中杀虫蛋白含量下降幅度大的，可溶性蛋白含量下降幅度也大，谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）活性下降幅度也大，游离氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性增加幅度也较大，品种间同样表现为常规种的变化幅度较大。可见，高温逆境条件会显著降低蕾铃中的Bt蛋白的表达量，这可能是因为高温逆境条件易导致蛋白质合成受阻，分解加快，这可能与高温逆境降低蛋白质的合成、促进蛋白质的分解密切相关。