森林微生物DNA提取研究范文

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作者：年士政单位：安徽省怀远师范学校怀远

在森林生态系统中,人们往往只注意到树木及其林下植被,而对林下土壤中的微生物认识很少。诚然,与参天大树相比,微生物的的确确微不足道,然而,微生物在森林生态系统中的功能性作用是任何人都不能忽视的。森林是微生物天然活动和繁衍的重要场所,微生物依赖植物而生存,同时微生物对森林乃至整个生态环境都有着重要的作用。试想,假如森林中没有腐生型微生物,森林中的枯枝落叶将不能分解,地球也将成为一个大垃圾库;假如森林中没有共生型微生物,营共生生活的植物物种将无法正常生长,许多植物将会从地球上消失;缺少微生物,森林生态系统中的营养循环和能量循环就无法实现。当然,在森林生态系统脆弱条件下,微生物也会给森林带来灾害,如流行性病害。随着人们对森林微生物的研究和认识的不断加深,许多新的研究方法和技术也相继得到了发展和应用。本文对dna分析技术在森林微生物学领域的应用和研究进展进行综述,希望对广大林业工作者有所启发。

1森林微生物DNA分析技术

1.1DNA技术概述

DNA分析技术是在一系列分子技术的基础上发展起来的,其中PCR(PolymeraseChainReaction)、RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)、AFLP(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)等技术是分子生物学技术的核心。以PCR技术(即聚合酶链式反应)为例,这一DNA分析技术是20世纪80年代末发展起来的一种快速体外基因扩增技术[1],原理是用于扩增位于两段已知序列之间的DN段,在DNA聚合酶催化作用及引物存在条件下,连续进行高温变性、低温退火、中温DNA合成这一循环。

1.2森林微生物DNA分析技术

在森林中,与参天大树相比,微生物显得非常渺小。由于微生物的/微观0特征,使得林业工作者们在研究森林微生物时困难重重,尤其是对微生物资源的分类鉴定,因此在一定程度上阻碍了人们对微生物在森林生态系统中的功能性作用的了解和进一步认识。借助DNA分析技术,无疑有助于鉴定和从量化角度去研究这些微观生命体。下面以森林真菌DNA分析技术为例,讨论森林微生物DNA的提取、纯化和分析方法。

1.2.1DNA的提取高等真菌DNA的提取,通常可以采用子实体/子囊果、孢子、担孢子或菌丝体等作为起始材料,DNA的提取可以直接从细胞的破碎开始。但由于从林地里采取的样品中,可能会混杂有植物材料,因此在进行DNA提取时要清除污染DNA,同时,还要考虑土壤及其它化合物的污染。鉴于真菌细胞壁结构特性,用于植物DNA的提取方法,需要根据情况做必要的修改和补充,才能取得较好的分离效果。真菌组织细胞和菌丝体细胞的破碎,通常采用液氮或干冰研磨。SDS(十二烷基硫酸钠)细胞壁裂解技术是常用的方法之一,在担子菌和子囊菌DNA的提取上十分有效[2]。另外,与植物DNA提取不同,对森林微生物细胞壁的破碎和DNA提取,通常不加细胞壁裂解酶,以避免目的DNA的降解;提取缓冲液中的EDTA浓度不宜过高,否则可能会影响核酸的活性。

1.2.2DNA的纯化根据真菌类型和DNA分析的要求不同,对DNA需要进一步纯化。DNA纯化通常采用酚、酚氯、氯仿等溶剂反复抽提,以降解并除去蛋白质杂质。也可采用CsCl密度梯度超速离心法。CsCl密度梯度超速离心是根据各分离物质密度的不同而达到分离的目的。分离蛋白质的CsCl密度大约为1.2g#ml-1,RNA密度较大,约为1.8g#ml-1,DNA约在1.5~1.7g#ml-1,同时还依赖于嵌入DNA中的溴化乙锭(EB)的量。较理想的CsCl终浓度在1.57~1.62g#ml-1。除此以外,还可采用蛋白酶K消化蛋白质杂质,或加入核糖核酸酶RNase消化除去RNA杂质。许多与树木共生的真菌,如豆马勃(Pisolithusspp.)、桩菇(Pax-illusspp.)等担子菌,多含有较高浓度的醛类物质,因此对这类微生物DNA的纯化需要特别小心。

1.2.3DNA的分析对微生物DNA分析之前,首先要对DNA含量和纯度进行评价。常用的评价方法有紫外分光光度法、荧光检测法和EB染色法。琼脂糖凝胶电泳法是微生物DNA分离鉴定和DNA纯化的常用方法。这一技术可分离出其它方法无法分离的DN段,而且分离的片段范围较广,不同浓度的琼脂糖凝胶可分离出长度在200pb~50kb的DN段。用EB染色便于在紫外灯下观察,有利于特定DNA条带的回收。目前一般实验室多采用水平板式凝胶电泳装置。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,凝胶的密度取决于琼脂糖的浓度。采用RFLP技术进行森林微生物DNA分析,是对含有特殊序列的DN段进行比较分析的常用手段。鉴于RFLP是对不同大小的DN段进行分析,因而对于带有不同的核酸序列却具有相近大小的DN段,用电泳的方法是不易区分开的,而DNA杂交技术可以显著提高灵敏度。

1.2.4DNA杂交技术在对森林微生物进行菌种鉴定,研究菌种个体间或其他分类水平上的亲缘关系,或进行环境检测时,都要借助DNA杂交技术。DNA杂交是ssDNA分子间具有高度同源性的核苷酸序列间的结合。探针序列被标记,以用来检测其与目的DNA结合的情况。采用35S或32P标记探针,经放射自显影技术可以对杂交产物进行观察和研究。在反应条件和探针选择方面,要考虑到杂交条件的限制性及探针的选择问题。

2DNA技术在森林微生物研究中的应用

2.1森林微生物的分类鉴定

由于森林微生物一般形体较小,结构较简单,传统分类学方法仅依赖于形态结构的描述,已很难保证分类的准确性和科学性,因而借助现代分子生物学手段可大大提高微生物的分类鉴定水平。在对森林微生物进行DNA分析时,需要根据微生物DNA结构的相似性和特异性,合成特异探针或引物。合成探针或引物的模板,可以是rRNA序列、染色体总DNA、rRNA基因的全部或非保守片段,甚至可以是rRNA基因保守区域及那些编码蛋白质、木质素酶、纤维素酶或色素产物的基因。研究者们对多种植物和微生物的rDNA进行了测序分析,发现ITS和IGS片段具有较高的稳定性,菌物学家Gardes和Bruns等以ITS片段为模板,合成了多种引物(表1)[3],其中ITS1-F对真菌类特异性较高,可用于从混杂的植物或其它微生物类群的基因中将真菌区分开来,而ITS4-B对真菌中的担子菌有很好的特异性。Erland等(1994)[4]采用引物CNL12(5p-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3p)和5SA(5p-CAGAGTCCTATGGC-CGTGGAT-3p)对外生菌根真菌TylosporafibrilloseDonk的rDNA进行了RFLP分析,该菌与其它外生菌根真菌具有显著不同的RFLPs图谱,因此可用于菌种的分离与鉴定。

2.2森林微生物多态性及亲缘关系的研究

在研究微生物亲缘关系时,通常用到DAN杂交技术。DNA杂交技术是建立在核酸碱基互补配对这一基本特性之上的。近些年来,在森林微生物研究中应用DNA分析技术,已取得显著进展,尤其在森林病原菌和林木共生菌(包括固氮细菌和菌根真菌)方面成绩斐然。Ry-giewicz等(1994)[2]研究了共生真菌DNA的提取和分析方法,使这一技术更趋成熟。Arm-strong等(1989)[5]从真菌子实体中提取DNA,然后采用限制性核酸内切酶对DNA进行酶切,得到的产物用于DNA的杂交研究,以揭示菌种间的亲缘关系。Cummings等(1990)应用限制性片段长度多态性(RFLP)技术,对丛枝菌根真菌的遗传关系进行了研究;Henrion等(1992)[6]对4种蜡蘑菌(Laccariabicolor、L.laccata、L.proxime、L.tortilis)的26个菌株的DNA分别进行PCR扩增,揭示出这些菌株在种间和种内存在多态性。研究发现,森林中常见的担子菌双色蜡蘑(Laccariabicolor),经过DNA提取和进行RFLP分析,如果采用完整基因杂交,放射自显影对RFLP的观察结果应与紫外观察的一致;但如果用探针编码一个从该菌中分离出来的特定基因,则在其染色体DNA的RFLP中通过放射自显影仅能观察到一条或几条带。在瑞典Karen等(1997)[7]通过对隶属17属的44种大型真菌rDNA的ITS区域进行CfoI,HinfI和MboI消化和RFLP分析,对真菌种间遗传多样性做了比较;并对部分菌种ITS序列进行了分析。Lobuglio等(1990)[8]对大型真菌土生空团菌(CenococcumgeophilumFr.)71个菌株的种内同源性及多样性进行了研究,种间相似性的变化范围较大(100%到44%),表明该真菌可能具有广泛的遗传多样性,同时也表明,该真菌的分类学地位尚有待深入细致的研究,例如,从分子生物学角度可能会分出几个不同的种来。

2.3展望

作为一门交叉学科的森林微生物学,在分别应用林学和基础微生物学研究方法的同时,借助当代分子生物学技术进行发展,将对森林微生物学研究带来无限生机。目前,林业微生物科学工作者在许多方面开展了有益的探索,尤其是在森林微生物分类鉴定、功能基因序列测定等领域取得了一定的成就。我们相信,分子生物学这一新兴技术的不断发展及其在生物学各学科的广泛应用,对加深认识森林微生物的功能与作用、开发和利用森林微生物、改善森林生态环境、造福人类有着重要的意义。