海水饲养体系下微生物研讨范文

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作者：刘长发姚敬元袁瑗刘卫东单位：近岸海洋环境科学与技术辽宁省高校重点实验室大连海洋大学大连海洋大学海洋科技与环境学院辽宁省海洋水产科学研究院

材料与方法

1材料

氨氧化细菌样品采自实验室规模的封闭循环海水养殖系统中填充塑料环载体的硝化作用滤器。采样前14d测得的硝化作用滤器的性能指标见表1。

2基因组RNA的提取

将适量附有生物膜的载体置于盛有150mL灭菌海水的250mL烧杯中，用磁力搅拌器搅拌。20min后采用2种方法浓缩菌体:一是过滤，用0．45μm微孔滤膜过滤、蒸馏水冲洗后置于－20℃备用;二是离心(HERMLZ323K，德国)，4℃下12000r/min离心5min，收集离心沉淀物备用。RNA提取采用经典方法的改进方法。于收集的菌体中加入6μL20mg/mL蛋白酶K、2μL0．2%β-巯基乙醇、0．6mL2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，55℃温育1h后消化，再加入酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合液，完全混匀后，12000r/min离心5min。取上清于一洁净离心管中，再加入氯仿-异戊醇(24∶1)混合液混匀后12000r/min离心5min。再取上清于洁净离心管中，加入双倍量的无水乙醇，混匀后置于－20℃下20min。高速离心产物以70%乙醇洗2遍之后风干。加入适量TE后置于－20℃保存待用。

3相关基因的PCR扩增

以提取的基因组RNA作为PCR反应模板，采用巢式扩增法对氨氧化细菌16SrRNA基因及氨单加氧酶基因amoA进行PCR扩增(Eppen-dorfS，德国)。具体方法是:先采用细菌16SrRNA基因通用引物11f和1492r(表2)进行大量扩增，之后再以特异性引物Nso1225和通用引物［18］EUB338对β-亚类氨氧化细菌进行扩增;还采用氨氧化细菌amoA基因特异性引物AmoA-1F和AmoA-2R对通用引物的PCR产物进行二次扩增。

4酶切连接

16SrRNA基因扩增片段的限制性酶切体系为2μLPCR产物，1μL缓冲液，1μL0．1%BSA及0．5μLTaqI内切酶，在65℃下温育4h进行酶切;amoA的限制性酶切体系为2μLPCR产物、1μL缓冲液、1μL0．1%BSA及0．5μLMspI内切酶，在37℃温育3h进行酶切。酶切后以接头引物在22℃下连接6h。在之后的PCR反应中，以接头引物与相应的RNA一端引物配对，使之只能扩增出一端的末端片段。

5溶胶液PCR

将1．4节中的PCR产物进行4．5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后胶板在空气中干燥约1h，用洁净的小刀将产物带割下，溶于纯净水1h，以6μL溶液作为模板进行PCR扩增。16SrRNA的引物为接头引物(TaqI)和末端引物(Nso1225或Eub338f)双引物;氨氧化细菌amoA引物接头引物(MspI)和末端引物(AmoA-1F或AmoA-2R)双引物。

6克隆测序、序列对比分析与系统发育分析

将得到的末端片段PCR产物送交宝生物工程(大连)有限公司进行克隆测序。测得序列在GenBank中进行BLAST(blast．ncbi．nlm．nih．gov/)搜索，寻同源已知菌，并采用ClustalX及MEGA3软件进行系统发育分析。

结果

1PCR片断酶切及扩增产物

图1为氨氧化细菌16SrRNA酶切片段及PCR产物电泳图。其中，左侧泳道为100bpRNAladderMarker，1、2泳道为酶切片段，为使酶切片段能更清晰的在电泳图上表现出来，采取了增加模板量的方法，虽然可能一些模板不被切开，但在连接液中使用的酶切液含模板较少，未切开的模版对结果影响很小。3、4、5泳道为引物TaqI+Nso1225的PCR产物，在10μL反应液中的模板浓度分别为0．125μL、0．25μL、0．5μL，结果是条带单一且均很亮;6、7、8泳道为引物TaqI+EUB338的组合PCR产物，在10μL反应液中的图1氨氧化细菌16SrRNA酶切片段及扩增产物电泳图Fig．1GelosegelprofileofAOB16SrRNAgenesequencesandPCR-amplifiedproducts模板浓度分别为0．125μL、0．25μL、0．5μL。由图1，引物TaqI+EUB338组合的PCR产物有多个清晰的条带，多态性明显高于引物TaqI+Nso1225的PCR产物。可选择引物TaqI+EUB338组合的PCR产物作为割胶扩增的模板。

2溶胶液PCR产物电泳

图2为引物TaqI+EUB338组合的氨氧化细菌16SrRNA正向末端酶切片段溶胶液PCR扩增产物电泳图。图中左侧泳道为100bpRNAladderMarker，奇数道为仅使用双倍量TaqI接头引物(0．4μL/10μL)的单引物即扩增产物，偶数道为使用TaqI接头引物(0．2μL/10μL)+EUB338组合引物的扩增产物。由图2可见，奇数道无条带，表明在单引物实验体系中无扩增产物，偶数道即在双引物实验体系中有扩增产物，且条带清晰、无拖尾，片段长度不同均在300bp以下，可用于基因克隆测序。图3为氨氧化细菌amoA正向末端酶切片段溶胶液PCR扩增产物电泳图。图中左侧泳道为100bpRNAladderMarker，其它泳道为amoA基因条带，均集中于100～200bp，长度接近，清晰无拖尾，PCR效果良好，可用于基因克隆测序。

3基因序列测定及系统发育树分析

对氨氧化细菌16SrRNA和amoA基因正向末端酶切片段溶胶液PCR扩增产物进行测序，共测得11条序列，其长度分布于200～300bp，16SrRNA基因序列的Blast分析结果见表3所示，amoA基因序列Blast分析结果见表4所示。序列11-8、11-8-1-2、11-8-2-2及序列10-6-1与亚硝化单胞菌群中Nitrosomonasoligotropha(EF016119、AJ298736)的相似度≥99%，可确定为同一属;序列35、36、37及11-8-7-2与亚硝化单胞菌属Nitrosomonassp．(AF386746、M96400、AY123811、DQ002459)的相似度为95%以上;序列2与Nitrosomonasaestuarii(AF272420)、序列4-26-1-4-1与Nitrosomonasmarina(AF272418)的相似度分别为100%，基本确定为同一种，属于亚硝化单胞菌群。仅有与Nitrosospiratenuis(AJ298746)的相似度为100%的序列10-6-3属于亚硝化螺菌属。由此可推断，在循环海水养殖系统硝化作用滤器氨氧化细菌中亚硝化单胞菌群占主体，存在少量的亚硝化螺菌群。图4为氨氧化细菌16SrRNA序列同源性分析图。由表4，对氨氧化细菌amoA正向末端酶切片段溶胶液PCR扩增产物进行测序，只测得3条序列，其长度在200～300bp。序列11-8-12、11-8-13与Nitrosomonassp．(AF386746、AF339041)相似度分别为87%和92%;序列9-26-4-1-2与Nitro-somonascryotolerans(AF314753)的相似度为87%。

相似度都不高，均属于亚硝化单胞菌群。由于测得的序列信息量相对较少，故未作聚类分析。

讨论

硝化作用过程一般包括两个转化步骤，第一步是氨氧化为亚硝酸(NH+4→NO－2)，第二步是亚硝酸氧化为硝酸(NO－2→NO－3)，其中第一步是限制性步骤。该步骤对氨氮转化为硝酸氮即对氨氮的去除有着很大影响。因此，分析循环海水养殖系统硝化作用滤器载体上附着的氨氧化微生物，对于明确硝化作用滤器的挂膜及生物膜对氨氮的去除有重要意义。

基于16SrRNA基因序列同源性系统发育分析结果表明，氨氧化细菌系统发育较单一，均属于变形菌门(Proteobacteria)的β-变形菌纲和γ-变形菌纲。其中β-变形菌纲又分为2个类群:亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌(Nitrosospi-ra)。基于16SrRNA的AFLP技术中使用巢式PCR在分析亚硝化单胞菌上具有高度的灵敏性和有效性。本实验采用氨氧化细菌16SrRNA基因特异PCR结合改良的扩增片段长度多态性(AFLP)方法，所测得的11条序列经Blast分析，大部分序列与亚硝化单胞菌群Nitrosomonasoligo-tropha、Nitrosomonasmarina及Nitrosomonasaesturii等序列相似度高，推断在生物滤器中有大量亚硝化单胞菌群存在;也有少数序列(10-6-3)与亚硝化螺菌群序列相似度高，推断在生物滤器中可能存在少量的亚硝化螺菌;还有一些序列经Blast分析发现其与埃希式杆菌属(GQ149348)具有一定的相似性，表明该硝化作用滤器中还可能存在一定数量的γ-变形菌纲细菌。本次并未检测到亚硝化叶菌属、亚硝化球菌属及亚硝化弧菌属的类似菌，还有待进一步的实验验证。

采用氨单加氧酶功能基因定性分析氨氧化细菌的分子生物学方法主要是分析amoA、amoB和amoC亚基组成的基因产物，其中amoA基因的定性分析可以反映出氨氧化细菌的种类、数量和活性。对氨氧化细菌的研究表明，盐分可以明显影响氨氧化细菌的多样性，河口区域氨氧化细菌多样性的减少与盐度升高相关，认为盐度是氨氧化细菌多样性和分布的环境控制因子，高盐区域的氨氧化细菌大多数类似于亚硝化螺菌属(Ni-trosospira)，而在中低盐度区域则分布着类亚硝化螺菌属(Nitrosospira)序列的氨氧化细菌，以及与Nitrosomonasureae、Nitrosomonasoligotropha和Ni-trosomonassp．Nm143相关序列的氨氧化细菌。采用氨氧化细菌amoA基因分析循环海水养殖系统硝化作用滤器载体上的氨氧化细菌得到的信息量相对较少。采用不同的16SrRNA基因序列引物和不同的PCR及电泳方法可能扩增出不同类群的微生物，因此在选择特异性扩增引物及PCR、电泳方法时，要兼顾扩增效率和扩增多样性两个方面。

如采用PCR-DGGE方法分析循环水养殖系统生物滤池中的细菌主要由拟杆菌门的黄杆菌纲和变形菌门的α-、β-、γ-变形菌纲的15种细菌组成，并且，初始氨氮越高的滤池中，亚硝化单胞菌属的细菌在生物膜上所占比例越高。Nso1225探针对β-变形菌纲氨氧化细菌具有高度特异性。

CTO189f/CTO654r引物扩增到的β-变形菌纲氨氧化细菌均属于Nitrosospira，但CTO189f/CTO654r引物难以扩增到Nitrosomonasoligotropha和Nitrosomonascommunis。鉴于不同引物对β-变形菌纲氨氧化细菌的扩增效率不同，可采用多对引物同时扩增目的基因，则可能得到更加全面的β-变形菌纲氨氧化细菌多样性结果。盐分可以明显影响氨氧化细菌的多样性，高盐度环境下，氨氧化细菌的多样性明显减少，但其数量明显增加。pH值也是影响氨氧化细菌群落结构的一个主要因素，pH不同，优势菌群也会不同。