泡菜中乳酸菌的抗菌性范文

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《中国调味品杂志》2014年第七期

1实验方法

1．1乳酸菌的分离纯化用无菌生理盐水稀释样品（泡菜水＋部分菜叶）液于一定浓度，取以上稀释液1mL于灭菌的MRS（加入了2％CaCO3）培养基中混匀，38℃培养48h。挑取平板底部和表面的、圆形或梭形的、有溶钙圈的乳酸菌疑似单菌落，在MRS平板中划线接种，38℃培养48h，平板纯化4代，确认为纯培养物后，对其进行革兰氏染色、镜检观察细胞形态、乳酸定性实验［4］等，转斜面，4℃保存。

1．2抗菌活性乳酸菌的筛选以大肠杆菌为指示菌，用牛津杯法测定以上各个乳酸菌代谢物的抑菌活性，测量抑菌圈大小，挑选出抑菌圈较大、较明显的菌株。

1．3指示菌菌悬液制备将实验室保存的3种指示菌活化后，分别接种于灭菌的普通肉汤液体培养基中，于38℃培养24h；将以上指示菌分别配制成（100～10－7）不同梯度的菌悬液，然后分别涂平板计数，测定其生长量。分离鉴定的产璞酵母接种于灭菌的YPD液体培养基中，于29℃培养24h。

1．4乳酸菌代谢产物的制备将分离鉴定的乳酸菌分别接种于MRS液体培养基中，于38℃培养48h，离心（4500r／min，15min），取上清液，在无菌工作台，经细菌过滤器（0．22μm滤膜）过滤，收集滤液即为乳酸菌的代谢产物，用pH计测定其pH值，用电位滴定法测定其总酸度［5］（以乳酸计），然后取出10mL中和pH至7．0，将代谢物原液和中性代谢物放入4℃冰箱备用。

1．5乳酸菌菌体制备将1．2．4分离得到的菌泥，用0．85％的无菌盐水洗涤，再离心（4500r／min，15min），如此重复3次，将最后一次得到的菌泥用0．85％的无菌盐水振荡摇匀，并调节生长量为107cfu／mL，4℃冰箱备用。

1．6指示菌最适生长量的测定抗菌活性测定［6］，用牛津打孔平板法，将融化的无菌水琼脂倒入大小一致的无菌平皿中，每个平皿15mL，待凝固后，用灭菌的镊子在每个平板的水琼脂上均匀放3个无菌牛津杯，分别取生长量约为9×103，9×104，9×105，9×106，9×107，9×108，9×109cfu／mL的指示菌原菌液1mL，加入30mL融化的普通肉汤培养基中，充分摇匀，倒入平皿中（不能倒在牛津杯孔里），待凝固后用镊子取出牛津杯，并在杯孔里分别加入0．2mL的各个乳酸菌代谢产物，于4℃冰箱放置6h［7］，以使代谢物充分扩散，然后于38℃培养24h，用卡尺量取抑菌圈直径，取平均值。

1．7乳酸菌代谢产物抑菌性测定方法同1．2．6。采用牛津打孔法，分别取生长量约为9×106cfu／mL的各指示菌原菌液进行测定。

1．8乳酸菌菌体的抗菌性测定将1．2．7中的0．2mL乳酸菌代谢产物换成0．2mL生长量为107cfu／mL的各乳酸菌菌体原液，其余步骤不变。

1．9乳酸菌中性代谢产物的抗菌性测定方法同1．2．7。将0．2mL乳酸菌代谢产物换成0．2mL中和后的代谢产物。

2结果与分析

2．1pH值及总酸度测定由表1可知，四川泡菜中的具有良好抗菌活性的10株乳酸菌代谢物的总酸度为6．02～15．67，pH值为3．59～4．87，说明在泡菜发酵过程中，乳酸菌均产生酸类物质，且酸性较强。

2．2乳酸菌对不同生长量指示菌的抑菌效果指示菌为大肠杆菌。由表2可知，除乳酸菌L8，L9，L10外，其他绝大多数的乳酸菌在指示菌生长量为9×106cfu／mL时的抑菌圈最大、最明显。所以，取指示菌的生长量为9×106cfu／mL时的原菌液作为测定乳酸菌抑菌活性的指示菌液。

2．3乳酸菌代谢产物抑菌活性与其酸度之间的关系由表3可知，除L7外，其他乳酸菌随着总酸度的升高，其代谢产物的抗菌性逐渐增强，证明其代谢产物中的抗细菌物质主要是酸类物质；且同一乳酸菌对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的抗菌性更强，对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抗菌性较弱；而对产璞酵母几乎无抗菌性；L7对产璞酵母有一定抑制作用。从以上结果可以看出，L7代谢产物中除了酸类物质还有其他的抗菌物质，可能是酶或者过氧化物等。

2．4乳酸菌抑菌活性与代谢物及菌体的关系由表4可知，当乳酸菌代谢物被中和至pH7．0后，除L3、L7、L10以外，其他乳酸菌都不具抗菌性；L7对细菌的抑菌圈半径也明显减小，而对产璞酵母的抑菌圈半径无明显变化。由此可得，在乳酸菌L7的代谢物中，除了酸，还有其他抗菌物质存在；L3和L10的代谢物中也可能含有微量的非酸类抗菌物质。除L3菌体有微弱抗菌性以外，其余乳酸菌菌体都无抗菌作用，证明乳酸菌的抗菌性基本上来源于其代谢产物。

3讨论

由于人体肠道中常见致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，且也是泡菜中经常易染的杂菌，故本实验以它们为指示菌；且泡菜中经常出现产璞酵母的生长繁殖，造成生花现象，所以研究乳酸菌对其的抑制作用，有望改善泡菜的品质。经过实验筛选得到1株对指示菌具有优良抗菌性的乳酸菌L7，经鉴定为植物乳杆菌［8］。除L7对产璞酵母菌有一定抗菌性以外，其余均无抗菌性。这主要是由于本次所得乳酸菌的抗菌性主要由其代谢物中的酸类物质起作用，而酵母菌可以在pH3．0～7．5范围内生长，所以产璞酵母的耐酸性较好，如果其代谢物中含有除酸类物质以外的其他抗菌物质，例如酶类、过氧化物、细菌素［9］等，则可显示对酵母较强的抑制作用。因此可以确定在L7的代谢物中存在酶类、过氧化物、细菌素等抗菌物质，或者其可以产生大量的新型生物防腐剂———苯乳酸。由于L3和L10的代谢物被中和以后还具有微弱抗菌能力，所以在L3和L7的代谢物中也存在除酸以外的其它抗菌物质。本次筛选得到的10株乳酸菌其代谢产物的抑菌效果与其酸度呈正相关性，酸度越大，其抑菌效果越明显，即乳酸菌代谢物的抗菌性在酸性环境中发挥得更好。L7对致病菌和产璞酵母均有一定抑制作用，对提高泡菜品质起重要作用。乳酸菌菌体本身基本不具有抗菌性，而其抗菌性主要是由其代谢产物作用的，在发酵食品中怎样合理利用乳酸菌代谢物的抗菌性有待进一步研究。

作者：杨婧尹礼国马伟玲张文学单位：四川大学轻纺与食品学院宜宾学院四川大学锦江学院白酒学院