醋蛋抗氧化肽思考范文

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《中国调味品杂志》2014年第七期

1醋蛋液酶解反应

1．1酶的筛选实验本试验选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，在各酶最适pH、温度、相同的添加量（E／S）对醋蛋液进行酶解反应，酶解物的DPPH•自由基清除率作为筛选最佳蛋白酶的指标。

1．2胃蛋白酶酶解醋蛋的单因素试验在酶解过程中，pH值、温度、时间和酶浓度对反应速度影响较大，通过实验确定适当的参数才能获取高活性的酶解产物。由于每一种酶都具有最适宜的pH值和温度范围，故本实验以DPPH•自由基清除率为指标对酶的添加量、酶解时间及底物浓度进行单因素分析，确定影响胃蛋白酶解的三个因素最适作用条件。

1．3酶解反应的正交试验考虑底物浓度、酶量和反应时间这3个因素，各因素水平见表1和表2。

2结果与分析

2．1蛋白酶活力

2．1．1标准曲线的制作首先以DL－酪氨酸作标准曲线。利用最小二乘法得到DL－酪氨酸浓度X（1μg／mL）与吸光度Y（OD680）之间的回归方程为：x＝100y－0．87。该方程R2＝0．9997，比色常数K＝100，符合酶活力测定的要求。酪氨酸溶液浓度与吸光值的关系标准曲线见图1。

2．1．2酶活力测定采用福林酚法酶促反应10min，测定不同蛋白酶的样品的吸光值，通过酶活计算式算出的5种蛋白酶的活力见表3。由表3中酶活数据可知，各种蛋白酶的酶活力具有较大差异，这是因为不同来源的蛋白酶其酶学特性不同，而且酶作用位点的专一性不同，针对相同的底物，其酶活力会有差异。研究表明：动物蛋白比植物蛋白容易酶解，而植物蛋白质中存在阻碍酶作用的结构，限制蛋白酶解，所以要对醋蛋白的水解用酶进行筛选，筛选出酶解产物抗氧化活性强、水解效率高的酶制剂。

2．1．3蛋白酶的筛选在醋蛋水解过程中蛋白酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的得率、反应速度，而且直接影响产品的风味和理化特性。蛋白水解物的生理活性取决于所用原料醋蛋的氨基酸序列、蛋白酶种类和醋蛋水解度的大小。本试验选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对醋蛋液进行水解反应，以此来比较酶种类对醋蛋液作用的差异。不同蛋白酶对醋蛋液水解度的影响：在4种蛋白酶的最适温度、最适pH值条件下酶解10h，相应的酶与底物的浓度比［E］／［S］为8000U／g、底物浓度［S］为1％。不同蛋白酶对醋蛋液水解度的影响见图2．由图2可知，在酶解约480min后，醋蛋液的Al－calase酶解物、胃蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物的水解度分别达到其最大水解度的1／2，而木瓜蛋白酶酶解物对醋蛋液的水解作用很小。原因是蛋白酶酶学特性不同、来源不同，水解作用差异较大。在4种酶的酶解进程中，因为Alcalase碱性蛋白酶和胃蛋白酶的酶活力高、溶解性好、专一性强等特点，所以水解过程比较理想。

2．1．4醋蛋液的不同蛋白酶水解物对二苯代苦味肼基自由基（DPPH•）的清除能力在酶与底物的浓度比［E］／［S］为8000U／g、底物浓度［S］为1％，在胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶4种蛋白酶各自的最适条件下水解8h，反应结束后，检测产物对DPPH•的清除率，结果见图3。由图3可知，4种蛋白酶的水解物都具有体外抗氧化作用，其中抗氧化作用最强的是胃蛋白酶酶解产物，其次是碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物。由此可见，醋蛋液经4种蛋白酶水解后都具有体外抗氧化活性的肽段，但各种酶的特异性肽段的种类和数量不相同，因而具有不同的体外抗氧化活性。由试验结果可以看出，胃蛋白酶酶解产物对DPPH•的清除能力较强，在醋蛋的酶解过程中具有较高的酶活力和稳定性。而疏水性氨基酸－COOH是碱性蛋白酶的切割位点，这就造成它酶解产物中会产生很多游离的疏水性氨基酸和末端为疏水性氨基酸的多肽，使得水解液苦味最大。而胃蛋白酶水解多肽的苦味程度较小，疏水性氨基酸从肽链中部移向末端，使苦味有所减弱，另外选择胃蛋白酶作为醋蛋液的水解用酶是模拟人体生物酶，成本低、来源广泛，适于工业化生产中使用，因此确定醋蛋液的最佳水解用酶为胃蛋白酶。

2．2胃蛋白酶单因素试验结果分析

2．2．1底物浓度对醋蛋液抗氧化性的影响胃蛋白酶在酶与底物之比为8000U／g、反应时间8h、pH2．0、温度37℃的条件下，分别对底物浓度为0．8％，1．5％，2．0％，2．8％的醋蛋溶液酶解，测定酶解产物对DPPH•的清除率，结果见图4。由图4可知，底物浓度在0．8％～2．8％范围内的醋蛋液抗氧化活性变化情况，酶底物浓度较低时清除率较小，随着底物浓度的增加，抗氧化性呈现上升的趋势。当底物浓度大于2．0％时，酶底物浓度再增加，抗氧化性基本不变，可能是由于醋蛋液的浓度过大比较黏稠、粘度增大，降低了酶解液的水分活度，影响蛋白酶扩散，对水解反应有抑制作用，所以底物浓度取值范围为1．5％～2．8％，这样可以提高酶解效率。

2．2．2酶用量对醋蛋液抗氧化性的影响由图5可知，酶用量在8000～14000U／g范围内醋蛋液抗氧化性变化情况，随着酶用量的增加，抗氧化性呈现下降的趋势。当酶用量为8000U／g时，醋蛋液抗氧化性达到最高。在底物浓度一定的条件下，浓度越大则酶与底物之间作用几率越大、越频繁，当酶量的增加使酶的数量过剩时，单位时间内多余的酶分子不与底物结合，水解程度增加在图表上表现变平缓的趋势。另外，酶本身是一种蛋白质，酶解底物的同时自身也会发生酶解，酶用量太大会干扰酶解物的生成。从成本上考虑，酶试剂价格较贵，过量添加成本较高。因而，在酶解时选择最佳的酶用量为6000～10000U／g。

2．3正交试验设计优化工艺流程根据单因素的最适水解条件，底物浓度（1．5％～2．8％），酶与底物浓度比（6000～10000U／g），研究酶底物比、底物浓度对酶解产物抗氧化性的影响，通过单因素试验确定取值范围。以酶解产物对DPPH•的清除率为指标，选用三因素三水平正交组合，以确定最佳酶解条件。通过酶解产物对DPPH•的清除率数据进行分析，建立DPPH•清除率与底物浓度、酶底物比和酶解时间的数学模型，并确定最优条件体系下DPPH•的清除率。正交试验方案结果见表4。由表4可知，通过回归正交试验结果确定胃蛋白酶的最佳水解条件是A2B2C3，即底物浓度2％，酶底物浓度比8000U／g，酶解时间为8h，实验数据中5号实验结果67．1％最高抗氧化数据，也正是在A2B2C3酶解条件下所获得的。

2．4抗氧化性比较在相同条件下，不同的酶解产物抗氧化大小不同，实验选取醋蛋液水解物、麦胚蛋白水解液和WPI乳清分离蛋白水解物与纯品Vc抗氧化性比较，实验结果见表5。由表5可知，各种酶解物抗氧化大小不同，其中醋蛋的胃酶酶解的抗氧化性达到67．10％，证明醋蛋酶解物具有的抗氧化性与其它酶解物相比较高，极具研究价值。

3结论

本试验选取两种动物蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）、一种微生物蛋白酶（Alcalase碱性蛋白酶）和一种植物蛋白酶（木瓜蛋白酶），对醋蛋液进行水解反应，以此来比较酶种类对醋蛋液作用的差异及水解效果。在底物浓度［S］为1％、酶与底物的浓度比［E］／［S］为8000U／g，分别在4种蛋白酶的最适温度、最适pH值条件下酶解10h。实验结果表明，胃蛋白酶是醋蛋液的最佳水解用酶。采用二苯代苦味肼基自由基（DPPH•）体系研究各酶水解物的抗氧化活性，确定酶解产物的抗氧化活性最强酶类。实验结果表明：4种蛋白酶的水解物均有体外抗氧化作用，但对DPPH•自由基的清除率有较大差异，其中具有较强清除自由基能力的是胃蛋白酶，其DPPH•自由基的清除率高达61．1％。由此可知，醋蛋液酶解产物具有较强清除自由基能力，即具有良好抗氧化活性。其酶解产物的抗氧化活性最强酶类是胃蛋白酶。通过正交试验确定胃蛋白酶的最佳水解条件：底物浓度2％，酶底物浓度比8000U／g，酶解时间为8h，在此条件下酶解产物对DPPH•的清除率为67．1％。实验在相同的条件下比较醋蛋液、麦胚蛋白、WPI乳清分离蛋白与纯品Vc抗氧化性比较，实验结果表明，醋蛋水解物的抗氧化性最高。

作者：陈黎斌刘岩成世盈许晓娜陈自立何国盛单位：广东食品药品职业学院