Taq基因在毕赤酵母中的表达范文

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《生物工程学报杂志》2014年第六期

1材料与方法

1.1菌种和质粒大肠杆菌XL10-Gold购于Stratagen公司。毕赤酵母GS115购于Invitrogen公司。毕赤酵母表达载体pHBM905A由本实验室构建[9]。

1.2主要试剂限制性内切酶NotⅠ、CpoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ，SolutionⅠ连接套装及DNA分子量标准均购于TaKaRa公司；质粒抽提和琼脂糖凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；蛋白分子量标准购于Fermentas公司；dNTPsMix购自捷瑞公司；Pfu高保真聚合酶购自东洋纺公司；所用PAGE纯引物在上海桑尼生物工程公司合成；二肽N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸(Z-Phe-Leu)为武汉Bioyears公司合成；其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.3Cpasetaq基因体外合成及表达载体pHBM905A-CpaseTaq的构建通过NCBI查询到该基因对应的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.P42663.2)，其下游额外添加6×His标签，总共517个氨基酸，利用DNAWorks3.2[10]依据密码子优化设计需要的引物(未列出)，采用两步合成全基因的方法[11]合成上述基因。载体pHBM905A以NotⅠ、CpoⅠ双酶切，目的基因经T4DNA聚合酶处理后与载体连接[9]，阳性克隆由上海桑尼生物工程公司测序并进行序列分析。

1.4质粒pHBM905A-CpaseTaq转化毕赤酵母GS115测序正确的重组质粒和空载体pHBM905A分别经SalⅠ线性化，溶液回收后各得10μgDNA。将线性化的质粒分别电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布MD平板，培养60h后利用菌落PCR鉴定阳性克隆，实验以转化空载体pHBM905A的酵母菌作为负对照。

1.5毕赤酵母重组子诱导表达诱导表达方法参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

1.6SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析方法分别参照Bio-Rad实验手册。

1.7羧肽酶Taq纯化将诱导72h后的培养基5000r/min离心10min，粗酶液经截留分子量为30kDa超滤膜超滤处理，并用50mmol/LTris-HCl(100μmol/LZn2+，pH7.2)洗涤粗酶液，继续超滤以除掉粗酶液中的培养基。亲和层析柱用50mmol/LPBS(10mmol/L咪唑，pH7.2)洗涤10个柱体积，缓慢加入超滤后的酶液。酶液和层析柱在4℃孵育90min，弃去未结合上清，层析柱用50mmol/LPBS(20mmol/L咪唑，pH7.2)洗涤20个柱体积。目的蛋白以50mmol/LPBS(50、100、150、200、250、300、350、400mmol/L咪唑，pH7.2)分别洗脱。

1.8去糖基化处理羧肽酶的脱糖基化实验参照NEB公司操作说明。1.9羧肽酶Taq酶活力测定及酶活力单位定义酶活测定参照Doi等的方法[12]，酶活测定以Z-Phe-Leu为底物，用50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，70℃反应15min，茚三酮作为显色剂，测定复合物在505nm处的光吸收值。配制不同浓度的亮氨酸标准溶液，绘制亮氨酸标准曲线。酶活单位定义：每1min水解生成1μmol亮氨酸所需的酶量作为一个酶活力单位(U)。

2结果

2.1表达载体pHBM905A-CpaseTaq的构建表达载体pHBM905A经NotⅠ、CpoⅠ双酶切，通过两步法合成基因，将回收的基因片段(图1A)连接到载体pHBM905A上，并转化至大肠杆菌XL10-Gold，转化子以基因专一性引物进行菌落PCR初筛，初筛质粒再经EcoRI、BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳显示出酶切后释放出大小3000bp左右的DN段带，与预期大小(3050bp)相符合，上述重组子(图1B)经上海桑尼生物工程公司测序，测序结果完全正确。

2.2毕赤酵母重组子鉴定及羧肽酶Taq诱导表达将鉴定正确的重组子摇瓶培养，每隔24h添加1%的甲醇作为诱导物，并同时取样。取40μL粗酶液上清，加入8μL6×SDS-PAGE上样缓冲液，于100℃煮沸10min，通过SDS-PAGE检测表达。结果显示重组羧肽酶蛋白分子量与理论值(58.8kDa)相符(图2)。通过蛋白质定量分析表明，诱导72h后总蛋白量可达到最大值0.1mg/mL，酶活力测定显示酵母发酵上清的酶活性为11.6U/mg，从第72h开始，总蛋白开始出现部分降解。

2.3羧肽酶Taq的纯化及活性测定洗脱成分经SDS-PAGE检测显示300mmol/L咪唑的PBS洗脱效果最好(图3)。粗酶液超滤后的酶活性为59.4U/mg，亲和层析纯化完的酶活性为77.6U/mg(图4)。经软件预测该蛋白不含潜在的糖基化位点，通过EndoH(29kDa)去糖基化处理该酶，也表明该蛋白没有被明显的糖基化(图5)。

2.4酶学性质分析酶活测定显示，在50mmol/LTris-HCl(pH7.5)中，最适作用温度为75℃(图6A)，在50mmol/L不同pH的反应缓冲液中，其最适作用pH为7.5(图6B)。

3讨论

动物来源的羧肽酶基因经常带有前肽编码序列[13-14]，异源表达都以酶原的形式存在，应用的前提是体外激活[1]，这种非特异性激活往往不能赋予酶完整的活性[15]，给应用带来障碍。国外羧肽酶Taq之前仅有在大肠杆菌中表达的报道,纯化极其繁琐，工业应用前景不强。本实验通过密码子优化，使羧肽酶Taq可以在毕赤酵母中有效大量地分泌表达。和传统的羧肽酶相比，羧肽酶Taq分泌出酵母细胞外时，以成熟的形式存在，且具备高活性80U/mg。并且纯化过程只需两步操作，就可以获得大量的高酶活羧肽酶Taq，这是大规模制备和生产羧肽酶Taq的基础。酶学性质实验发现，组氨酸标签融合的羧肽酶Taq最适pH和温度与天然的酶有一定差别。天然酶的最适pH为8.0，最适温度为80℃，本实验研究组氨酸标签融合重组酶的最适pH为7.5左右，最适温度为75℃，在70℃以上，该酶保持较高活性。产生该差异的机制目前并不清楚，毕赤酵母表达的分泌蛋白往往容易发生N-糖基化，N-糖基化往往可以改变酶的某些生物学活性[16]，通过去N-糖基化处理发现毕赤酵母表达的羧肽酶Taq不带有N-糖基化，然而是否是组氨酸标签影响了羧肽酶Taq最适作用pH和温度仍然有待研究。由于羧肽酶水解能力差，作用底物范围小，羧肽酶极少应用于工业生产。而本研究中的重组羧肽酶Taq具有高酶活和广泛的底物特异性等特点，有大规模应用于工业酶法水解多肽的前景，但是该酵母工程菌在小肽水解方面的工业应用值得我们更深入的探索。

作者：余先红汪晓娟钟星唐微翟超陈晚苹马立新单位：湖北大学生命科学学院湖北省工业生物技术重点实验室生物资源绿色转化湖北省协同创新中心湖北大学知行学院生物工程系