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《生物工程学报杂志》2014年第六期
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种和质粒大肠杆菌DH5α为本实验室保存；宿主菌毕赤酵母GS115、质粒pPICZαA购自Invitrogen公司。
1.1.2试剂及仪器拟南芥ArabidopsisthalianacDNA为山东大学微生物国家重点实验室所赠；Taq酶、DNA连接酶、限制酶均购自大连宝生物公司；DNA柱纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；DNA及蛋白标准分子量、质粒提取试剂盒以及T载体购于北京全式金公司；LB培养基、YPD培养基均按照Invitrogen公司毕赤酵母表达手册配制；其他试剂为国产和进口分析纯试剂。所用仪器：2720ThermalCyclerPCR仪；国产DYY-12电泳仪；Bio-RadGenePulserⅡ电转化仪；岛津GCMS-QP2010气质联用仪。
1.1.3引物据拟南芥硫酯酶基因AtFatA(GenBank:AK176105)设计引物，上游、下游引物分别命名为P1、P2，并分别引入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位点(下划线)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。
1.2方法
1.2.1PCR反应获取目的片段以拟南芥的cDNA作为模板，进行PCR扩增。反应条件：94℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃2min；30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行柱回收。
1.2.2构建重组T载体pEASY-Blunt-AtFatA将T载体及上述PCR反应所得基因产物分别进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应，胶回收基因片段和相同酶切的T载体，按照一定比例连接得到重组T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将其涂布于含有30µg/mLZeocin抗性平板，37℃恒温箱隔夜培养，蓝白斑筛选，用灭菌牙签挑取抗性单克隆菌落，分别以P1、P2作上、下游引物，进行菌落PCR初步验证。 按对应序号在同浓度Zeocin抗性低盐LB培养基中扩培，提取重组T载体，酶切二次鉴定，然后将通过验证的重组T载体送至上海生工测序最终验证。
1.2.3重组质粒pPICZαA-AtFatA的构建摇菌并提取、纯化重组T载体、pPICZaA质粒，对二者分别进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应，胶回收AtFatA基因片段和相同酶切的pPICZαA质粒，按照一定比例连接得到重组质粒后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(图1)，然后按照1.2.2中重组T载体的操作方法对其进行抗性筛选；37℃隔夜培养后见白色菌落。进一步对所构建的重组质粒pPICZαA-AtFatA进行如上重组T载体的三步验证，确保重组质粒构建成功以及所携目的基因的精确。
1.2.4重组质粒pPICZαA-AtFatA的转化和鉴定将提纯的pPICZαA-AtFatA质粒用SacⅠ限制酶单切线性化后，电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布于含有120µg/mLZeocin的YPDS平板，30℃培养4−6d，筛选到阳性转化子。同浓度ZeocinYPD培养基扩培后提取重组菌的基因组，以P1和P2为引物进行PCR鉴定，同时以转化过空载体的菌株作空白对照。
1.2.5外源蛋白的诱导表达与检测挑取Mut+重组子，接种至含50mLBMGY培养基的500mL三角瓶中，30℃、250r/min振荡培养20h；3000r/min离心5min，弃去上清，再以50mLBMMY重悬菌体；菌液置于500mL挡板瓶中，用四层纱布封口，28.5℃、250r/min振荡培养，诱导表达；每24h向培养基中添加除菌的无水甲醇使其终浓度为0.5%，诱导72h，收集发酵物。取少量发酵产物离心，收集发酵上清液与发酵既得菌体。在缓冲液保护下将菌体破壁、3000r/min离心5min处理，保留上清。同时取野生菌进行相同发酵条件及后期处理，以作空白对照。用SDS-PAGE法分别对发酵上清液和破壁离心后菌体上清液进行蛋白检测。
1.2.6胞外游离脂肪酸的检测用气质联用法(GC-MS)检测胞外游离脂肪酸种类及含量，进而间接评估外源硫酯酶蛋白活性。将1.2.5中的发酵上清液进行脂肪酸甲酯化处理，处理方法参考文献[17]。GC-MS色谱条件：毛细管柱为DB-5MS，载气为高纯氦气(99.999%)，进样器温度230℃，检测器温度250℃，载气柱头压65.2kPa。程序升温条件：初始温度90℃，保持3.5min，5℃/min升至250℃，保持5min。分流比设定为1：30，每次进样量为1μL。
2结果与分析
2.1目的基因扩增以拟南芥的cDNA作为模板，由PCR扩增得到约1200bp的目的片段，大小与拟南芥硫酯酶基因预测值相符，说明目的基因克隆成功。
2.2重组T载体及重组质粒的构建与鉴定硫酯酶基因扩增片段插入T载体、重组质粒。经菌落PCR及对提取重组T载体、重组质粒分别酶切验证(重组质粒双酶切验证如图2所示)，硫酯酶目标片段经DNA测序后，将测序结果与GenBank(AccessionNo.AK176105)序列进行比对分析，结果显示PCR扩增所得基因片段序列与拟南芥FatA型脂酰-ACP硫酯酶目的基因序列相似度达到100%，未发生碱基突变或丢失，表明目标基因(AtFatA)扩增获得成功。
2.3重组质粒的转化将构建完成并测序无误的重组质粒通过电转化法整合到毕赤酵母GS115基因组中，从抗性平板上挑取阳性菌落，经YPD液体培养基摇瓶培养48h，提取酵母基因组，以P1，P2为引物进行PCR鉴定，证明阳性转化子基因组为模板成功克隆出AtFatA基因，重组质粒整合进入毕赤酵母基因组，重组菌构建成功，命名为Pichiapastoris-AtFatA。digestionofrecombinantplasmidpPICZαA-AtFatA.
2.4外源蛋白的诱导表达与对照菌相比，整合有拟南芥硫酯酶基因的重组菌在阳性转化子诱导表达后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对胞外蛋白检测，并未发现差异蛋白；但对胞内蛋白进行检测时，发现重组菌多出一条大小约45kDa的蛋白(图3中6、8泳道所示)，这与拟南芥硫酯酶预测的相对分子质量大小相符。这说明重组菌株表达的外源蛋白成功，但是并没有直接将外源蛋白分泌至胞外，而是以胞内蛋白形式存在。比对胞内外蛋白电泳图，分析认为目的蛋白没有分泌至胞外的原因可能有以下两点：一是目的蛋白分泌到胞外后被胞外的蛋白酶所降解。从图3的1−4泳道中可以看到胞外确实存在微量非目的蛋白(约38kDa处)的蛋白条带，说明了蛋白酶存在的可能性。相同条件下重新摇瓶发酵，发酵液中添加蛋白酶抑制剂以作对照。发酵结束后取对照组发酵上清液进行SDS-PAGE检测仍得到完全一致的结果，未见目的蛋白条带，这说明1−4泳道中的微量蛋白并非蛋白酶，排除蛋白酶干扰的可能性；二是目的蛋白没有按照预期设计分泌到胞外，而是以胞内蛋白的形式存在。由于目的蛋白的分泌受外源基因的特性如基因密码子组成，信号肽的准确表达与引导，目的蛋白分泌前在胞内相关细胞器上的正确修饰与传送以及该目的蛋白本身的空间结构等多种因素影响，上述任一因素的干扰都可能会最终导致目的蛋白的分泌失败[18-20]。
2.5胞外游离脂肪酸的检测分别收集野生菌及重组菌的发酵上清液，对胞外游离脂肪酸进行甲酯化处理，并分别对两组甲酯化产物进行GC-MS检测，结果如图4、5所示。分析对比该两组相同检测条件下的图谱可知，重组菌与对照菌均主要含6种胞外游离脂肪酸，分别为辛酸(8：0)、月桂酸(12：0)、肉豆蔻酸(14：0)、棕榈酸(16：0)、油酸(18：1)、硬脂酸(18：0)，这说明重组菌中AtFatA基因的表达并没有改变菌体产生胞外游离脂肪酸的种类。与野生菌相比，重组菌Pichiapastoris-AtFatA生产胞外游离辛酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的能力分别为野生菌的151%、110%、85.5%、68.2%、62.7%和75%。重组菌比野生菌胞外游离MCFAs(主要是辛酸)产量增加51%，MCFAs产量在胞外总游离脂肪酸产量中所占比例达到28.7%，高出野生菌10.6%。
3讨论
实验在宿主菌毕赤酵母GS115的基因组上插入外源AtFatA基因对其进行基因改造并成功表达，大幅度提高了胞外游离MCFAs的产量，使得直接从发酵液中方便地分离提取MCFAs成为可能，免去了破碎细胞提取发酵产物的繁琐，节约生产成本，利于工业化生产。与外源硫酯酶的植物表达系统[21]相比，该表达系统的培养、转化及高密度发酵等操作接近原核生物，表达系统简单[16]，非常适合规模化生产；而与该外源酶的原核表达系统[22]相比，该真核表达系统则具有一定的蛋白质翻译后加工能力，有利于真核蛋白的表达[16]，且该系统不产生内毒素，更适和用于食品及医药品的生产。值得一提的是外源AtFatA基因是以基因重组的方式整合到毕赤酵母的基因组上，故而外源基因在毕赤酵母中比较稳定，不会发生原核表达系统传代过程中类似质粒丢失的现象[23]。毕赤酵母表达系统具有稳定、低毒、代谢可控以及适和规模发酵等诸多优点，该研究方法对指导生产食品及药用MCFAs具有一定的积极意义。但我们认为要想将此技术运用到工业生产上还存在以下两个问题：第一，该实验只是通过摇瓶发酵的方式对该重组菌产MCFAs的性能进行了检测，其生产MCFAs的能力虽较野生菌有一定程度提高，但要想进一步提高其产量，扩大到工业化生产，实现规模发酵还需摸索诸多条件，如该重组菌在发酵罐中产MCFAs的最适温度、pH、及供氧量乃至最适发酵周期等，这些因素都将对发酵效率产生影响[24-26]；第二，如何从发酵液中安全、稳定、方便地分离或提取MCFAs的工艺尚需进一步摸索。在此分离或提取过程中应尽量不引入对人体有毒害作用的提取剂，从而确保生产出的MCFAs在食品及药用等方面的安全性，又可减少产物后期处理中为除去引入的有毒提取剂而徒增的工艺流程，节约生产成本。相信随着对巴斯德毕赤酵母研究和认识的进一步深入以及化工行业分离提取技术的蓬勃发展，上述的两个问题短期内即可得到解决，届时利用工程菌的代谢生产MCFAs亦会具有一定的应用前景。
作者：郝昭程王腾飞李忠奎郝梓凯戴琨王瑞明单位：齐鲁工业大学食品与生物工程学院