IBV核蛋白的表达纯化范文

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《中国生物工程杂志杂志》2014年第七期

1方法

1．1病毒繁殖、纯化及RNA抽提ibvH52毒株经尿囊腔接种10dSPF鸡胚增殖后，用PEG20000透析浓缩，经SDS-PROK方法抽提RNA，直接进入逆转录体系。

1．2RT-PCR和cDNA克隆参照报道IBVBeaudete株N基因序列设计一对引物［8］:引物P1:5''''GGATCCATGGCAAGCGGTAAAGCAG3''''，对应于N基因ORF的1～19位，含BamHⅠ位点和ATG起始密码子;引物P2:5''''CCGAGCTCTCAAAGTTCATTCTCTCC3''''，对应于N基因ORF的1211～1230位，含SacⅠ位点和终止密码子。引物由北京奥科生物公司合成，使用前稀释成终浓度20mmol/L。RT-PCR以10μl病毒RNA为模板，按Promega公司cDNA合成说明书合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，PCR扩增整个基因，反应条件为94℃30s，50℃45s，72℃1min30s，35个循环后72℃10min。PCR产物经鉴定后按试剂盒操作方法克隆到pMD18-T载体中，构建pT-NP质粒，并转入E．coliDH5α克隆并用于测序。

1．3序列测定及分析重组质粒经北京奥科生物技术公司测序，然后将序列测定结果与GeneBank中的有关数据进行同源性分折。

1．4重组表达载体的构建将pT-NP和pGEX-KG分别用BamHⅠ和SacⅠ酶切，回收1．2kb左右的N基因片段与用相同的酶消化的pGEX-KG片段，T4连接酶在16℃定向连接构建GST融合表达载体pGEX-NP。重组表达载体转化E．coliDH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB琼脂平板进行筛选培养，并对阳性进行PCR及酶切分析鉴定。

1．5转化菌的诱导表达及表达产物的检测纯化将鉴定正确的重组质粒分别转入宿主菌E．coliBL21(DE3)进行筛选诱导表达，转化菌的表达产物的提取按pGEX表达系统操作手册进行。表达产物的SDS-PAGE电泳和Westernblot分析按参考文献［9］进行，目的蛋白的纯化按Hi-TrapGST纯化柱的操作说明进行。

1．6间接ELISA方法的建立酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件的选择:通过方阵滴定方法，确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。抗原从1∶20稀释到1∶640，血清从1∶10稀释到1∶320，按其稀释度分别加到酶标板的1至6行和1至6列，阴性血清按阳性血清同样的稀释度加到第7至12列，按间接ELISA方法进行操作，测定OD450值，计算阳性OD值比阴性OD值(P/N值)，结果最大的孔所对应的抗原包被浓度和血清稀释度，判为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。结果判定标准的确定:将临床未经免疫的144份鸡血清，进行ELISA检测，计算平均值x，标准差s，阴阳界限值按计算公式:x+3s确定。重复性试验:用相同批次、不同批次的酶标板，对抗体水平不同的6份血清样品进行批内、批间重复性测定，参照参考文献［10］计算批内、批间的吸收变异系数。交叉性试验:分别检AIV、NDV、IBDV、EDS76等禽常见病毒的标准阳性血清，同时设阳性血清、阴性血清和空白对照。阻断试验:将IBVH52阳性的鸡胚尿囊液与等体积IBV阳性血清混合，37℃作用45min，作倍比稀释，ELISA检测，同时设不做任何处理的正常尿囊液和阳性血清混合物作为对照。诊断特异性、敏感性与符合率试验:选用国内外公认的检测方法，即血凝抑制试验(HI)作为参照试验方法，与本研究建立的ELISA诊断方法相比较，确定该ELISA诊断方法的诊断特异性、敏感性与符合率。血凝抑制试验(HI)按OIE手册中方法进行［11］。间接ELISA的应用:用建立的ELISA方法检测江夏、新洲、黄陂等地区临床送检的400份血清。

2结果

2．1N基因的克隆

RT-PCR产物电泳显示，目的片段在1．2kb左右，将目的基因回收后连到pMD18-T载体转入E．coliDH5α，提取质粒，用BamHI和SacⅠ双酶切切出1．2kb、2．7kb左右的两条带，用BamHI单酶切仅一条(图1)，这说明所挑选的克隆产物为目的基因正向插入质粒，其大小与预期一致。通过测序，测得N基因序列长度为1230bp，编码409个氨基酸，涵盖了从ATG至TGA一个完整的阅读框。通过NCBIBLAST方法进行分析，该基因与LKQ3(H52)毒株同源性最高，为97%，以上表明扩增片段为目的基因。

2．2表达载体构建及鉴定

将pGEX-NP质粒转化的细菌经培养，挑取单个菌落培养用于小量制备质粒DNA，并通过酶切、PCR筛选正确插入目的基因的重组质粒。结果显示，BamHⅠ和SacⅠ双酶切产物电泳后可见清晰的1．2kb和4．9kb的2条带;经BamHI单酶切消化，电泳后可见一条大小约6．1kbDNA带(图2)。这说明我们获得了正确插入目的基因的阳性克隆。

2．3表达产物的SDS-PAGE和Westernblot分析

SDS-PAGE电泳结果显示:含pGEX-KG的E．coliBL21的对照在约26kDa有明显的表达带，相当于GST蛋白的大小，含重组质粒pGEX-NP的大肠杆菌在约80kDa处有明显的表达带，相当于N蛋白与GST蛋白融合表达的产物，结果表明目的基因在重组菌中获得了表达;经扫描分析，在IPTG诱导3h左右的细菌中，该蛋白表达量占总蛋白量的25%，达到最高(图3)。Westernblot分析表明:重组表达的80kDa蛋白带，能与IBV的标准阳性血清发生特异性的免疫反应，证实表达产物具有很好的免疫学活性(图3)。

2．4NP-ELISA的建立与应用

2．4．1NP-ELISA最适条件及阴阳界限的确定试验表明抗原的最佳包被浓度为1．75μg/ml，抗原最佳稀释度为1∶40，血清最佳稀释度为1∶80，阴性血清平均OD值x等于0．178，s等于0．061，求得阴阳界限为x+3×s=0．178+3×0．061=0．361。结果判定标准的确立:以空白孔调零为背景，在酶标仪上测各孔OD450值，若OD450≥0．361判为血清抗体阳性，表明疫苗免疫鸡群产生了相关抗体或非免疫鸡群受到了野毒的感染;若OD450＜0．361判为阴性。

2．4．2交叉性试验结果表明无关病原抗体OD值均在临界值0．361以下，说明此方法与AIV、IBDV、NDV、EDS76等病原抗体无交叉反应，特异性强(表1)。

2．4．3重复性试验结果表明批间重复的吸收变异系数在3．62%～9．49%之间，批内重复的吸收变异系数在3．29%～7．97%之间，说明该诊断方法具有良好的重复性。2．4．4诊断特异性、敏感性与符合率试验HI试验和ELISA试验检测同一批血清的阴阳性结果如表2所示，结果显示，以HI试验作为参照，ELISA试验的诊断敏感性为97．29%，特异性为60．60%，符合率为88．89%，说明该方法具有良好的诊断特异性、敏感性与符合率(表2)。2．4．5阻断试验可以看出经含IBV的尿囊液处理的阳性血清OD值明显降低，而经健康鸡胚尿囊液处理的阳性血清的OD值没有明显变化(图4)。2．4．6间接ELISA在临床的应用统计表明，临床样品的阳性率为89．0%，这说明NP-ELISA方法能很好地应用于临床IBV抗体检测(表3)。

3讨论

核衣壳蛋白(N)是IBV的3种主要结构蛋白之一，在遗传进化中最为保守，不同毒株间同源性最高(达94%～99%)，病毒感染过程中表达量最大(S∶M∶N3种蛋白的摩尔比为1∶6∶15)，与病毒的组装和机体细胞免疫等方面有重要相关性，因此研究N蛋白基因的克隆表达对该病有重要的意义。本研究中，将外源基因插入在GST蛋白基因的下游，表达出可溶性的融合蛋白GST-NP，利用GST亲和层析柱进行了纯化。高纯度表达蛋白的获得为ELISA检测方法的建立奠定了良好的基础，特别是在克服动物体内大肠杆菌抗体对检测方法的干扰方面有重要的意义。纯化的产物有两种，一种蛋白表达量高，片段较大，为主要产物，另一种表达量较低，片段较短，是附带产物，这与相关融合报道的情况相同，可能是蛋白表达时部分蛋白在C端提前终止或发生了降解。Westernblot分析与ELISA试验均表明，纯化后两种主要表达蛋白均具有很好的免疫学生物活性。

用大肠杆菌表达的重组N蛋白取代原病毒作为诊断抗原，是诊断技术发展的一种趋势，优势有以下几点:首先，重组N蛋白具有良好的免疫原性，发现在大肠杆菌中表达的Gray株N蛋白可与多种血清型IBV抗体发生良好反应。其次，目前传染性支气管炎病毒的检测方法有两种，分别是病原学方法和血清学方法。N蛋白可作为抗原进行血清学检测，保守性好，可以检测各种血清型的抗体，不存在病原检测中范围狭窄的问题，具有更高可信度。再者，该蛋白易于制备纯化，成本廉价，建立的检测方法安全性好、诊断对象单一，准确性高，从制备、应用效果上均优于昆虫细胞表达的N蛋白，该蛋白对将来IB新型疫苗的研制和IBV的消除必然有一定的意义。

为对ELISA方法的特异性、敏感性与符合率进行评定，本实验进行交叉性、阻断性、重复性试验，同时将NP-ELISA诊断方法与血凝抑制试验(HI)相比较，结果表明NP-ELISA检测的敏感性、符合率很高，但特异性稍微偏低，这可能由于两种方法的诊断原理和判断标准不同所致。首先，灵敏度不同，HI虽是一种比较公认的检测方法，但其灵敏度不高，而ELISA可达到血清中和试验的2．3倍，AGP的188倍，具有很高灵敏度;其次，两种方法检测的对象不同，NP-ELISA专一性地检测NP蛋白抗体，诊断对象单一，影响因素少，非特异性小，而HI则是检测胰酶消化过的IB病毒，其中胰酶本身、盐离子浓度、温度等对血凝性都具有很大的影响，影响因素多，特异性差;再者，实验稳定性不同，ELISA可以通过一系列的量化方法控制反应条件，而HI实验极易受胰酶消化效果和病毒的类型等不可量化控制的条件影响。所以NP-ELISA与HI相比的特异性偏低，仅能表明本方法的敏感性比HI更高，稳定性更好，更适合于动物免疫或感染后早期抗体监测。

作者：李中华肖运才毕丁仁胡思顺吴仁蔚单位：福建省动物疫病预防控制中心华中农业大学动物医学院