陆川猪FTO基因的克隆及生物信息学探讨范文

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摘要：为了获得广西陆川猪肥胖相关基因(fto)编码区序列(CDS)，试验利用基因克隆技术，从陆川猪背最长肌组织中提取总RNA，扩增出FTO基因CDS，并运用Lasergene7.0、ExpasyProtaram、ExpasyProtscale、NPS@在线蛋白分析系统和SWISS-MODEL在线分析预测系统等分析软件对扩增出的序列进行生物信息学分析。结果表明：通过克隆测序得到的陆川猪FTO基因CDS全长为1518bp，与GenBank中公布的乌金猪FTO基因CDS的同源性为99.9%，与苏钟猪FTO基因CDS的同源性为99.6%；陆川猪存在第1050位点的C→G，碱基G为陆川猪所特有，导致天冬氨酸突变为谷氨酸；通过建立系统进化树发现，陆川猪与乌金猪的遗传距离最近，它们聚为同一支；陆川猪FTO氨基酸组成中亮氨酸含量最高，占氨基酸总数的11.7%，FTO蛋白具有较强的亲水性；陆川猪FTO蛋白的二级结构包含α螺旋、无规则卷曲和延伸链。说明陆川猪FTO基因具有高度的保守性，今后在陆川猪脂肪沉积的研究中，FTO基因可作为主要候选基因之一。

关键词：陆川猪；FTO；基因；克隆；软件；生物信息学分析

肥胖相关基因（fatmassandobesityassociatedgene,FTO）是第一个被发现与一般人群肥胖有关系的可靠候选基因，近年来因其可调节脂肪细胞沉积，进而调控肥胖发生而广受人们的关注[1]。JFischer等[2]研究发现，敲除小鼠的FTO基因后，突变后的小鼠不再肥胖，而缺失FTO基因会导致刚出生的小鼠发育比较缓慢、脂肪组织和去脂体重显著减少，从而减少肥胖的发生。研究发现，FTO基因在调节能量平衡、新陈代谢、食欲、去甲基化等方面具有非常重要的作用[3-5]。目前，人、山羊、牛等物种的FTO基因序列已在GenBank上公布。关于FTO基因在猪上的研究也有一些报道，如Z.Q.Du等[6]研究发现，猪的FTO基因定位在6号染色体上；如黄英等[7]以乌金猪的脂肪组织作为模板，成功克隆得到FTO基因序列；付言峰等[8]成功克隆得到苏钟猪的FTO基因。然而到目前为止还未见关于广西地方优良品种陆川猪FTO基因编码区序列（CDS）的克隆及生物信息学分析的报道。本试验采用基因克隆技术，从陆川猪背最长肌组织中克隆FTO基因，并运用生物软件对该基因的序列进行生物信息学分析，旨在为弄清陆川猪FTO基因表达与脂肪沉积的相关性奠定基础。

1材料

1.1试验动物

陆川猪,由广西畜牧所提供，屠宰后采集陆川猪的背最长肌组织，装入灭菌消毒的冻存管中,立即置液氮中冷冻，迅速转入-80℃冰箱中保存，备用。

1.2主要试剂

RNAisoPlus、反转录试剂盒，均由TaKaRa公司生产；胶回收试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司生产；大肠杆菌DH5α感受态细胞，南京诺唯赞生物科技有限公司生产；DL-2000Marker，广州东盛生物科技有限公司生产；2×TaqMasterMis，康为世纪生物科技有限公司生产。

2方法

2.1陆川猪背最长肌组织总RNA的提取及反转录

剪取约100mg组织样品置预冷过的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状后转入1.5mLEP管中，加入RNAisoPlus1mL，之后按照反转录试剂盒说明书提取RNA，以总RNA为模板进行反转录。反转录体系（总体积为20μL）：OligodTPrimer1μL，10mmol/LdNTPMixture1μL，模板RNA2μL，5×PrimeScriptⅡBuffer4μL，RNase抑制剂0.5μL，PrimeScriptⅡRtase1μL，无RNA酶水10.5μL。反转录程序：42℃30s；95℃5s；5℃5s。

2.2引物的设计

参照参考文献[错误!未定义书签。]设计FTO基因引物序列，并由深圳华大基因科技有限公司合成。引物序列：FTO-F5′-ATGAAGCGAACCCCAACC-3′和FTO-R5′-CTAGGGTTTGGCTTCCAG-3′，预计FTO基因的扩增片段大小为1518bp。

2.3FTOcDNA的克隆

反应体系（总体积为15μL）：2×TaqMasterMix7.5μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA1μL，无RNA酶水5.5μL。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃再延伸5min。取PCR产物6μL，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后c用紫外凝胶成像仪观察并拍照。按照胶回收试剂盒说明书回收纯化FTO基因目的片段，将目的片段与pMD18-T克隆载体连接过夜；次日将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用菌液涂布LB平板，次日挑选阳性克隆至含氨苄西林的LB液体培养基中。取含有目的片段的重组菌液，送至深圳华大基因科技有限公司测序。

2.4陆川猪FTO基因与同物种间的序列比对

利用Lasergene7.0生物分析软件对陆川猪FTO基因CDS与同物种间FTO基因CDS进行同源性及氨基酸突变分析。

2.5陆川猪FTO基因同源性比较及系统进化树构建利用

Lasergene7.0生物分析软件中MegAlign程序对测序得到的陆川猪FTO与其他物种FTO基因CDS进行同源性分析并构建系统进化树。

2.6陆川猪FTO氨基酸组成分析

利用NCBI在线预测软件ORFFinder将测序得到的FTO核苷酸序列翻译成氨基酸序列，然后利用ExpasyProtaram在线分析系统对陆川猪FTO的氨基酸序列进行分析。

2.7陆川猪FTO亲疏水性分析

利用ExpasyProtscale在线分析系统对陆川猪FTO的亲疏水性进行分析。2.8陆川猪FTO基因二级、三级结构的预测分别利用NPS@在线蛋白分析系统和SWISS-MODEL在线分析预测系统预测和分析陆川猪FTO蛋白的二级、三级结构。

3结果与分析

3.1陆川猪FTO基因CDS的PCR扩增

采用RT-PCR方法成功克隆得到陆川猪FTO基因，其PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果条带位置与预期序列长度1518bp一致，见图1，因此可以初步确定此条带为陆川猪FTO基因CDS。经深圳华大基因科技有限公司测序发现，获得了陆川猪FTO基因CDS，其长度为1518bp。

3.2陆川猪FTO基因与同物种间的序列比对

通过克隆得到的陆川猪FTO基因CDS与GenBank中公布的猪FTO基因(NM_001112692)CDS的同源性为99.5%；用陆川猪FTO基因CDS与NCBI中发表的乌金猪(JQ031263)和苏钟猪(JX873956)这两种猪的FTO基因CDS进行对比，同源性分别为99.9%和99.6%，证实所克隆的片段为陆川猪FTO基因CDS序列。陆川猪FTO基因CDS与其他猪相比，存在第1050位点的C→G，碱基G为陆川猪所特有，导致天冬氨酸突变为谷氨酸。此外，与GenBank中公布的猪FTO基因(NM_001112692)相比，陆川猪FTO基因CDS第38位点的G→A，导致甘氨酸突变为谷氨酸，第509位点的C→T，导致丙氨酸突变为缬氨酸，第614位点的G→A，导致丝氨酸突变为天冬酰胺，第796位点的A→G，导致天冬酰胺突变为天冬氨酸，第988位点的G→A，导致丙氨酸突变为苏氨酸；第213位点的A→G，第594位点的C→G，但均为同义突变。与GenBank中公布的苏钟猪(JX873956)相比，陆川猪FTO基因CDS第614位点的G→A，导致丝氨酸突变为天冬酰胺，第1330位点的G→A，导致丙氨酸突变为苏氨酸；第213位点的A→G，第594位点C→G，但均为同义突变。与GenBank中公布的乌金猪(JQ031263)相比，陆川猪FTO基因CDS第163位点的T→G，导致半胱氨酸突变为甘氨酸。

3.3陆川猪FTO基因同源性比较及系统进化树构建

利用Lasergene7.0生物分析软件中的MegAlign程序对测序得到的陆川猪FTO基因编码区序列与NCBI中的乌金猪(JQ031263)、牛(BC140478)、人(NM_001080432)、绵羊(EU072419.1)、苏门答腊猩猩(NM_001132778)、山羊(NM_001319276)的FTO基因编码区序列进行同源性比较，结果同源性分别为99.9%、87.9%、87.3%、87%、86.8%和86.7%。

3.4陆川猪FTO氨基酸组成分析

利用ExpasyProtaram在线分析系统分析陆川猪FTO的氨基酸序列，推测出陆川猪FTO蛋白分子质量为58132.05u，等电点为5.19。

3.5陆川猪FTO蛋白的亲疏水性分析

借助ExpasyProtscale在线分析系统预测FTO的亲疏水性，其中正数表示疏水，数值越大表示疏水性越强；而负数表示亲水，数值越小表示亲水性越强。

4讨论与结论

近年来，FTO基因可通过调控机体摄食和脂肪代谢影响肥胖而广受学者的关注[9]。在动物营养与肉质调控领域中，FTO基因在影响动物肉品质的关键因素——脂肪沉积和代谢方面的研究也取得了一定进展。林亚秋等[10]克隆出简州大耳羊FTO基因，并发现24月龄山羊股二头肌和背最长肌FTO基因表达量要比8~10月龄、1~3月龄高，背最长肌FTO基因表达量与其肌内脂肪（IMF）含量呈负相关，相关系数（r）等于-0.415。李倩等[11]研究发现，FTO基因在成都麻羊臂三头肌中的表达量与IMF含量的相关系数是-0.821，呈高度负相关，说明在山羊肌内脂肪沉积中FTO基因很可能发挥了重要调控作用。林森等[12]克隆出藏鸡FTO基因CDS，并发现藏鸡不同发育阶段不同肌肉组织中FTO基因表达水平与其IMF含量呈不同程度的相关。付言峰等[8]研究发现，FTO基因在苏钟猪不同组织中的表达量不同，从低到高的排序为背最长肌＜肝脏＜肺脏＜心脏＜背膘，这与M.B.Madsen等[13]以哥廷根小型猪作为试验动物的研究结果一致。陈友贵等[14]研究发现，10月龄贵州白冼猪不同组织中FTO基因由小到大的顺序是胃<肝脏<大肠<肌肉<肺脏<小肠<心脏<肾脏<脾脏。朱琳娜[15]研究发现，180日龄脂肪型猪种金华猪的肌肉和脂肪组织中FTO基因表达量要比同日龄瘦肉型长白猪和中间型长金猪高，此研究结果说明此基因与肥胖和机体能量代谢间的相关性较高。黄英等[7]研究发现，云南乌金猪脂肪和肌肉中均有FTO基因的表达，但肌肉中的表达量比脂肪低。本试验克隆得到陆川猪FTO基因CDS，长度为1518bp，与GenBank中公布的中国云南地方脂肪型猪种乌金猪FTO基因CDS的同源性为99.9%，与江苏自主培养杂交瘦肉型苏钟猪FTO基因CDS的同源性为99.6%。此外，陆川猪FTO基因CDS与其他猪相比，存在第1050位点的C→G，碱基G为陆川猪所特有，导致天冬氨酸突变为谷氨酸。研究发现，猪FTO基因定位在调控众多脂肪性状的数量性状位点的6号染色体区域上[6，16]。故FTO基因的表达很可能与陆川猪的脂肪沉积和代谢存在密切关系，从而对陆川猪优质肉质性状的形成造成影响，其潜在的机制需要进一步探讨。用生物软件分析陆川猪与乌金猪、牛、人、绵羊、苏门答腊猩猩、山羊这几个物种的FTO基因CDS的同源性，发现同源性达到86.7%以上；同时构建物种系统进化树，结果表明，陆川猪与乌金猪遗传距离最近，它们聚为同一支。对陆川猪FTO氨基酸组成分析发现，亮氨酸含量最高，占氨基酸总数的11.7%，FTO蛋白具有较强的亲水性；对陆川猪FTO蛋白二级、三级结构进行预测，发现其包含α螺旋、无规卷曲和延伸链。

5结论

本试验成功克隆了陆川猪FTO基因的CDS序列，其突变位点可能影响陆川猪肌内脂肪沉积，进而影响肉质，今后对陆川猪脂肪沉积进行研究时可以FTO基因为主要候选基因之一，本试验为深入揭示FTO基因在陆川猪脂肪沉积和脂肪代谢中的调控作用奠定了基础。

参考文献：

[1]王辉,孟雁.肥胖基因FTO的研究进展[J].国际内分泌代谢杂志,2010,30(2):116-118.

[5]陈静,孙琳.FTO基因rs9939609研究进展[J].中国医药导刊,2011,13(4):682-683.

[7]黄英,杨明华,毕保良,等.乌金猪FTO基因的克隆和表达分析[J].生物技术通讯,2014,25(3):316-322.

[8]付言峰,李兰,王学敏,等.苏钟猪FTO基因的mRNA表达、克隆测序及其生物信息学分析[J].华北农学报,2013,28(1):128-134.

[10]林亚秋,廖红海,贺庆华,等.山羊FTO基因克隆及其表达谱[J].畜牧兽医学报,2016,47(5):888-898.

[11]李倩,林亚秋,廖红海,等.成都麻羊FTO基因组织表达及其与IMF含量的相关性研究[J].黑龙江畜牧兽医,2016(04上):97-99.

[12]林森,林亚秋,朱江江,等.藏鸡FTO基因表达的时空特性及与肌内脂肪含量的相关分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(7):1191-1201.

[14]陈友贵,冯文武,龙威海,等.白洗猪不同组织FTO基因的表达研究[J].基因组学与应用生物学,2015,34(5):926-930.

[15]朱琳娜.FTO、METTL3基因表达对猪脂肪细胞mRNAN6-甲基腺苷水平及脂肪沉积的影响研究[D].杭州:浙江大学,2014.

作者：夏琴；吴永文；瞿秋红；崔悦悦；邹辉；蒋钦杨；黄艳娜 单位：广西大学动物科学技术学院