枣园绿盲蝽越冬卵的寄生作用范文

本站小编为你精心准备了枣园绿盲蝽越冬卵的寄生作用参考范文，愿这些范文能点燃您思维的火花，激发您的写作灵感。欢迎深入阅读并收藏。

《中国生物防治学报》2016年第三期

摘要:

在华北地区枣园中，发现了绿盲蝽的一种卵寄生蜂，形态鉴定为盲蝽黑卵蜂Telenomussp.。直接观察寄生蜂羽化情况表明，绿盲蝽越冬卵中盲蝽黑卵蜂的寄生率为0.67%～1.25%。设计了盲蝽黑卵蜂的特异性引物，对绿盲蝽越冬卵的分子检测显示，寄生率为13.04%～23.91%。与直接观察方法相比，分子检测技术能更加准确地评估盲蝽黑卵蜂对绿盲蝽卵的寄生作用。

关键词：

绿盲蝽；盲蝽黑卵蜂；枣园；越冬卵；寄生作用

绿盲蝽Apolyguslucorum（Meyer-Dür）是当前我国棉花、枣、梨、葡萄等多种农作物生产中的一种重要害虫[1-3]。绿盲蝽成虫和若虫均能以口针刺吸为害寄主植物的幼嫩组织，导致叶片破损、落蕾落花、果实畸形等，对农作物产量和品质造成严重影响[4,5]。我国系统开展了绿盲蝽天敌资源的调查研究[6,7]，其中优势若虫寄生蜂——红颈常室茧蜂PeristenusspretusChenetvanAchterberg已实现人工规模饲养与田间释放应用[8,9]。绿盲蝽的卵常产在植物组织中，仅留卵盖在植物表面，卵盖长不足1mm，颜色较浅，肉眼难于发现；同时，卵多为散产[4]。这一习性使得绿盲蝽卵难于收集与观察，限制了对其卵寄生蜂的研究。1958年，朱弘复和孟祥玲[10]记载了盲蝽的3种卵寄生蜂：点脉缨小蜂Anagrussp.、盲蝽黑卵蜂Telenomussp.和柄缨小蜂Polynemasp.，但由于绿盲蝽卵收集难而未对其田间寄生率进行详细调查。研究发现，秋季绿盲蝽末代成虫偏好在果树枝条修剪残茬等部位上产卵，越冬卵分布相对集中[5,11]，这为绿盲蝽卵寄生蜂的种类调查等研究提供了可能。本文对华北地区枣园中绿盲蝽卵寄生蜂种类进行了调查，并利用直接观察和特异性引物检测2种方法评估了寄生蜂对绿盲蝽越冬卵的寄生情况。

1材料与方法

1.1室内观察2011、2013、2014和2015年的4月初，在绿盲蝽越冬卵孵化之前，从中国农业科学院廊坊科研中试基地（河北廊坊，39.53ºN，116.70ºE）周边的枣园中剪取枣树断枝。枣园面积约为3hm2，枣树品种为“金丝小枣”，树龄为5年，树高3m。在枣园随机剪取枣树断枝，带回室内在显微镜下，用昆虫针将断枝茬口的绿盲蝽越冬卵逐一挑出，将完好的卵放入底部铺有一层吸水纸的培养皿（直径为9cm）中，加入一个湿润棉球进行保湿，然后将培养皿盖好后放置于25℃、RH65%、光周期14L:10D的培养箱中，逐日观察与记录寄生蜂的羽化情况。将羽化后的寄生蜂保存在75%的乙醇中，用于形态鉴定。

1.2分子检测

1.2.1供试虫源绿盲蝽采自中国农业科学院廊坊科研中试基地棉田，用新鲜的四季豆PhaseolusvulgarisL.豆荚在室内进行继代饲养[12]。用于寄生蜂引物特异性检测的非靶标昆虫中黑盲蝽Adelphocorissuturalis（Jakovlev）、苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus（Goeze）、三点盲蝽Adelphocorisfasciaticollis（Reuter）和牧草盲蝽LyguspratensisL.同样为实验室种群。枣树ZiziphusjujubeMill.、葡萄树VitisviniferaL.枝条均采自中国农业科学院廊坊科研中试基地周边果园。供试昆虫取样前，先饥饿24h，以去除腹部残留食物。植物枝条用清水冲洗干净后，于20℃下保存备用。

1.2.2DNA提取提取昆虫基因组DNA前，将单头昆虫于清水浸泡12h，去除可能存留于体表的杂质。之后将虫体转入1.5mL离心管中，用研磨棒将其磨碎，按照TIANampGenomicDNAKit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书单头提取绿盲蝽及非靶标昆虫的DNA，试剂购自天根生物（北京）有限公司。将剪碎的1g植物组织放入研钵中，加入液氮用研磨棒磨碎，用DNAsecureplantkit新型植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生物（北京）有限公司，进行DNA提取。

1.2.3引物设计先用COI通用引物（LepF1：5′ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG3′和LepR1：5′TAAACTTCGGATGTCCAAAAAATCA3′）扩增绿盲蝽卵寄生蜂COI序列，测序后根据物种间不同碱基位点设计并获得寄生蜂的引物。PCR扩增总体系为20μL，包括0.4μLdNTPs（2.5mmol/L），2.0μLEasyTaqbuffer（10×），0.4μL正向引物（10μmol/L），0.4μL反向引物（10μmol/L），0.2μLEasyTaqDNA酶，15.6μLddH2O和1.0μLDNA模板。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃后延伸10min。

1.2.4引物特异性检测以常见盲蝽（绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、牧草盲蝽）[13]和绿盲蝽的主要越冬寄主（枣树、葡萄树）[14]作为非目标物种模板，以待测的绿盲蝽卵寄生蜂作为阳性对照模板，清水作为阴性对照，应用上述所设计的引物对以上模板进行PCR扩增，检测该对引物的特异性。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。

1.2.5引物灵敏度检测以绿盲蝽卵寄生蜂DNA提取液为母液，进行2倍梯度稀释，应用筛选到的特异性引物和1.2.4所述程序进行PCR扩增，直到稀释液模板未能检测到目的条带为止。

1.2.6卵寄生情况检测2014和2015年的4月初，分别于河北廊坊、山东沾化（37.69ºN，118.12ºE）的枣园中随机采集枣树枝条，在显微镜下观察并收集绿盲蝽越冬卵。沾化枣树品种为“冬枣”，树龄为6年，树高2m。提取单粒卵基因组DNA，应用上述特异性引物检测寄生蜂对绿盲蝽越冬卵的寄生情况。

2结果与分析

2.1室内饲养寄生率2011年以及2013—2015年，从河北廊坊的枣园中分别采集绿盲蝽越冬卵6000、9500、5800与400粒，其中寄生蜂寄生率依次为0.67%、1.14%、0.72%与1.25%，4年平均寄生率为0.90%（表1）。经形态鉴定，调查发现的寄生蜂为盲蝽黑卵蜂Telenomussp。

2.2分子检测寄生率

2.2.1引物特异性检测以绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、牧草盲蝽以及枣树、葡萄树等非目标物种模板为对照，检测引物TeF1/TeR1的物种特异性。结果表明，该引物仅对盲蝽黑卵蜂具有扩增能力，扩增片段为225bp，片段单一且清晰，对非目标物种不具有扩增能力，证明该引物具有很强的特异性（图1）。

2.2.2引物灵敏度检测对特异性引物TeF1/TeR1做最低检出限检测，以梯度稀释后的盲蝽黑卵蜂DNA（初始浓度为9.80ng/μL）为模板进行PCR扩增。检测结果显示，该引物具有较高的灵敏度，最低检出限如泳道5所示为0.61ng/μL（图2）。

2.2.3寄生率检测对河北廊坊、山东沾化枣园中绿盲蝽越冬卵进行寄生率的检测，结果显示，盲蝽黑卵蜂对绿盲蝽越冬卵具有较强寄生能力。2014年，河北廊坊绿盲蝽越冬卵的寄生率为23.91%；2014年和2015年，山东沾化地区枣园绿盲蝽越冬卵寄生率分别为13.04%和20.73%（表2）。

3讨论

物种特异性引物检测技术是一种基于PCR的快速检测方法，近年来发展迅速，已成为害虫与天敌寄生关系研究及其寄生率评估的重要手段[15-18]。Agusti等[19]发展了汤普森厉寄蝇Lydellathompsoni（Herting）和稻苞虫赛寄蝇Pseudoperichaetanigrolineat（aWalker）的COI特异性引物，检测其对玉米上玉米螟Ostrinianubilali（sHübner）滞育幼虫的寄生情况，发现二者对玉米螟的寄生率均较低，分别为2.16%和2.83%。Traugott等[20]设计了半闭弯尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen、粉蝶盘绒茧蜂Cotesiaglomerata（L.）和微红盘绒茧蜂Cotesiarubecula（Marshall）的COI特异性引物及其多重PCR检测体系，对结球甘蓝有机种植园中3种害虫进行检测发现，半闭弯尾姬蜂对小菜蛾Plutellaxylostella（L.）的寄生率为33.4%；粉蝶盘绒茧蜂对欧洲粉蝶Pierisbrassicae（L.）、微红盘绒茧蜂对菜青虫Pierisrapae（L.）的寄生率分别为52%和53.4%。

本研究设计了盲蝽黑卵蜂的COI特异性引物，检测发现在枣园中对绿盲蝽越冬卵的寄生率在13.04%～23.91%，表明该寄生蜂对绿盲蝽卵具有较强的控制作用。发展的盲蝽黑卵蜂分子检测技术能有效克服盲蝽卵小、其寄生蜂研究难的问题，有助于后续开展不同季节绿盲蝽卵寄生率的系统调查。盲蝽黑卵蜂COI特异性引物对中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、牧草盲蝽以及葡萄树同样不具扩增能力，具有特异性，为下一步评价盲蝽黑卵蜂对上述盲蝽种类的寄生作用、以及在葡萄园的控害功能奠定了基础。在昆虫寄生作用的评估中，分子检测结果与直接观察法所得结果常相差较大。如Ashfaq等[21]检测紫花苜蓿地中的淡足常室茧蜂Peristenuspallipes（Curtis）对盲蝽的寄生作用，其中90%以上为Lygusborealis（Kelton）所寄生，常规饲养法测得2001年和2002年的羽化率分别为29%和21%，远小于PCR检测的寄生率78%和64%。这主要因为羽化率评估中忽视了寄生蜂未成功发育羽化的情况，会低估寄生效率。同时，和直接观察法相比，PCR检测技术甚至可以检测到处于卵期的寄生蜂[22]。

本研究中盲蝽黑卵蜂饲养寄生率不足2%，远远低于PCR检测所得的寄生率。在1个多月的直接观察过程中，我们发现大量越冬卵因失水干瘪、被微生物寄生等原因而死亡，既不出蜂也不孵化，这是导致上述结果差异的主要原因。综合上述分析，PCR检测技术可以更加准确有效地评估寄生蜂的寄生能力，同时极大地缩短了寄生率检测时间。本研究首次探究寄生蜂对绿盲蝽卵的控制能力，为生产上这种天敌的挖掘利用提供科学依据，同时为优化绿盲蝽防治技术提供新思路。

作者：李金花 潘洪生 杨帆 罗淑萍 袁海滨 陆宴辉 单位：天津科技大学机械工程学院