黄曲霉毒素产生的机制初探范文

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《现代食品科技杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1材料与试剂试验材料：黄曲霉菌CGMCC3.2890，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，PDA培养基4℃保存。试剂：黄曲霉毒素B1（aflatoxinB1，AFB1），购于sigma公司；总茶多酚（TP）、槲皮素（quercetin）、没食子酸（gallicacid）、儿茶素（catechin）及其衍生物包括（-）-没食子儿茶素（GC）、（-）-表没食子儿茶素（EGC）、（-）-表儿茶素（EC）、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG）、(-)-儿茶素没食子酸酯（CG）、（-）-没食子儿茶素没食子酸酯（GCG），均购自NacalaiTesqueInc.（Kyoto，Japan），纯度大于98%；活性氧荧光探针Carboxy-H2DCFDA（Eugene，OR）、愈创木酚、三氯乙酸、TBA、TCA、槲皮素、过硫酸铵、SDS、ß-巯基乙醇、联苯、抗坏血酸、四甲基乙二胺、核黄素、铁氰化钾等，均为分析纯。

1.2仪器与设备荧光分光光度计（RF5301），日本岛津公司；倒置荧光显微镜（NIKONTE2000-S）日本尼康公司；研磨珠均质器（Mini-Beadbeater-16）美国Biospec公司。

1.3方法

1.3.1茶多酚抑毒抑菌活性检测采用96孔板培养法，对各种茶多酚单体的抑毒活性检测。每孔含有沙氏液体培养基200μL（含有黄曲霉孢子1×105CFU/mL）。向各孔中分别加入各种茶多酚单体溶液，使各种茶多酚单体的浓度分别为5、10、25、50、100、200、400、800、1000μg/mL。加完茶多酚单体的96孔板放在28℃的培养箱中培养60h，然后对每孔培养基中的黄曲霉毒素进行检测。同时根据每孔黄曲霉的生长状况，记录各种茶多酚单体抑制黄曲霉生长的MIC（肉眼可以观察到的最低完全抑制浓度）。

1.3.2AFB1提取及含量测定吸取一定量黄曲霉培养滤液，加三倍氯仿萃取，萃取液于60℃下用氮吹仪吹干，溶解于甲醇中，过0.22μm微孔滤膜，然后用HPLC测定AFB1的含量。色谱柱：COSMOSIL5C18-MS-IIPackedColumn（4.6mmI.D.×250mm）（上海泉岛公司）；柱温：22℃；进样量：10μL；检测波长：365nm；流动相：乙腈：甲醇：水（1:1:2，V/V/V）；流速：1mL/min[13]。

1.3.3胞内活性氧（ROS）水平槲皮素处理过的黄曲霉及对照组经过24、36、48、60、72h的培养，分别采样。取得的菌丝经磷酸缓冲液（PBS）洗涤后，加入20μmol/L活性氧荧光探针carboxy-H2DCFDA（Eugene,OR），在30℃条件下孵育30min；使用PBS洗涤两次，然后加入1mLPBS缓冲液和0.1g小玻璃珠，通过Mini-BeadBeater-16（Biospec，USA）破碎菌丝；破碎的菌丝液在10,000g离心，取上清，通过考马斯亮蓝法测定其可溶性蛋白含量，并通过荧光分光光度计测定其荧光强度（激发光450nm，发射光520nm）。同时取部分未经过beater破碎的菌丝通过荧光显微镜观察。

1.3.4脂质过氧化分析MDA的浓度可作为黄曲霉细胞脂质过氧化指标。槲皮素处理过的黄曲霉及对照组经过24、36、48、60、72h的培养，分别采样。取得的样品通过6,000g离心10min后收集菌丝，然后在2mL含有10%三氯乙酸中均质。匀浆在10,000×g离心10min，吸取2mL的上清液，与2mL的TBA溶液（0.25%TBA溶于10%TCA）混合。混合液在95℃条件下加热30min，然后迅速冷却，随后在6,000g离心10min，上清液在532nm测其吸光度，在600nm测定非特异吸光度。MDA含量计算依据公式：C=6.45（D532-D600）-0.56D450

1.3.5SOD、CAT和POD活性测定POD酶活测定采用愈创木酚法[14]，取500mLpH6.0PBS缓冲液置于烧杯中，加入280μL愈创木酚，加热溶解完全，冷却至室温后加30%过氧化氢190μL混匀，制成反应液。取3mL反应液加入0.5mL粗酶液，37℃温育30min，于470nm波长下测定OD值。以37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产物生成1μg的底物酶量为一个酶活单位。SOD酶活测定采用NBT（氯化硝基四氮唑兰）光还原法[14]。吸取2.4mL50mmol/LpH7.8磷酸缓冲液，加入0.2mL195mmol/L硫氨酸，0.1mL3μmol/LEDTA，0.2mL1.125mmol/LNBT，0.1mL核黄素60μmol/L，最后加入0.1mL粗酶液。加完1号管避光，其他管置于4000Lx日光灯下25℃准确反应10min，反应结束后所有管用黑布遮盖以终止反应，避光管为对照，在波长560nm测定OD值。以每毫克蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。CAT活性测定：配制0.3%H2O2溶液作为底物溶液：吸5mL30%H2O2，用0.05mol/LpH7.0PBS定容到500mL。反应体系包含1mL0.3%H2O2溶液、1.9mLH2O、0.1mL酶液，测定OD240nm降低速度。将每毫克蛋白每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

1.3.6RT-PCR将黄曲霉菌接种在含有50mL沙氏液体培养基的三角瓶中，加入槲皮素，使其终浓度达到100μg/mL，放入28℃的摇床中，120r/min摇动培养。分别在48h（产毒前期），72h（产毒初期），以及96h（产毒中后期）取样。通过2层纱布过滤除掉培养基，将获得的菌丝放入液氮中速冻备用。菌丝体RNA采用试剂盒方法提取（Qiagen,Inc.，Valencia，CA，RNeasyplantminikit）；用LAMDA-25紫外可见分光光度计测定260和280nm的吸收值，由260nm吸收值计算RNA含量[15]，由OD260/OD280得知总RNA纯度；取等量RNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，检查RNA的完整性。将提取的菌丝总RNA用“FirstStrandcDNASynthesisKit”（TOYOBO，Japan）进行第一链cDNA的合成；引物序列和退火温度参照表1。

1.4数据分析运用SPSS12.0数据处理系统，采用Duncan’s新复极差法（DMRT）进行显著性分析。所有图表数据的结果都是三次实验数据的平均值±SD。

2结果与分析

2.1槲皮素对黄曲霉菌丝生长和毒素产生的抑制各种茶多酚单体和茶多酚混合物均表现出了对黄曲霉毒素的抑制作用，但是能够在低于1000μg/mL完全抑制黄曲霉毒素产生的茶多酚单体只有GC、C、ECG、EGC和槲皮素（表2）。其中槲皮素的活性最强，在100μg/mL时就能完全抑制黄曲霉毒素产生。而且槲皮素是唯一能够在低于1000μg/mL（800μg/mL）完全抑制黄曲霉生长的茶多酚单体（表2）。

2.2槲皮素处理缓解黄曲霉菌丝内氧化胁黄曲霉菌丝内氧化还原平衡状态被证实与产毒密切相关[16]。槲皮素本身具有抗氧化活性，因此槲皮素可能会对黄曲霉菌丝的氧化胁迫水平产生影响。试验结果表明槲皮素处理导致黄曲霉菌丝内ROS水平普遍低于对照（图2a、b），在处理24h后仅为对照的38.72%，到处理后72h时，达到对照的68.23%，明显缓解了黄曲霉菌丝内氧化胁迫。MDA含量分析结果表现出了相同的趋势：槲皮素处理导致MDA水平下降，在处理24h后达到对照的63.83%，到处理后72h时，达到对照的68.98%（图2c）；这表明槲皮素可以缓解黄曲霉菌丝脂质过氧化。

2.3槲皮素激发了黄曲霉体内抗氧化系统Yap1是抗氧化系统的转录因子，能够启动抗氧化系统的转录。RT-PCR结果显示Yap1在产毒前期就被激活，转录水平大幅提升，而且在整个产毒过程一直处于较高的表达水平（图3a、b）。进一步的抗氧化酶活性检测结果确定了黄曲霉在槲皮素作用下抗氧化系统的激活，POD、CAT、SOD都得到了显著的提高（图4）。通过计算得出槲皮素处理导致黄曲霉菌丝POD活性增加了2.13倍，CAT活性增加了1.76倍以上，SOD活性增加了84.24%。

2.4槲皮素抑制产毒相关基因的表达黄曲霉产毒相关基因成簇存在于基因组内，其中AflR和AflS是调控基因。为了深入了解槲皮素对毒素产生抑制的机制，我们选择了部分跟产毒相关的基因，并对它们的转录状况进行了检测。这些基因涵盖了黄曲霉毒素合成相关基因簇的上、中、下游[17]。RT-PCR结果显示无论是调控基因还是结构基因在槲皮素存在的条件下转录水平都发生了下调，但是下调程度各不相同（图5a、b）。总的来说槲皮素对调控基因aflR和aflS的下调程度弱于对合成基因的下调程度；尤其aflK的转录对槲皮素处理的响应最明显（图5b）。这些结果暗示槲皮素可能通过下调调控基因来影响合成基因的转录，因为槲皮素的调控信号这个过程发生了放大现象。

3讨论

据联合国粮农组织（FAO）估计，每年全世界平均有2%的粮食由于霉变而不能使用，由黄曲霉毒素污染所造成的损失可达数千亿美元。黄曲霉毒素的合成调控网络非常复杂，至少25个基因参与了黄曲霉毒素的合成调控[16]。目前已发现的黄曲霉毒素抑制剂主要包含生物碱、抗生素、双黄酮、钙离子阻断剂、香豆素类、黄酮类、氧肟酸、氧类脂、多烯不饱和脂肪酸、萜类化合物、某些挥发组分等[7]，但是关于它们的作用机制目前研究较少。黄曲霉菌体内的氧化还原状态被证实与产毒密切相关[17]。槲皮素具有良好的抗氧化能力[9]，我们的研究结果证实，槲皮素处理能够缓解黄曲霉菌的氧化胁迫状态。但是槲皮素在各种茶多酚中不是抗氧化能力最强大的，其抑制毒素产生的能力却最强。因此，除了自身的抗氧化能力，应该还有其他机制的参与。我们的研究结果表明，槲皮素能够激活抗氧化系统转录因子Yap1，导致黄曲霉体内的抗氧化酶活性增加，这种诱导机制很可能是槲皮素抑制AFB1产生的关键因素。氧化还原平衡参与毒素产生调控主要是通过调控黄曲霉毒素调控基因AflR来实现的[17]。我们的研究发现槲皮素既能下调AflR的表达，又能下调AflS的表达。而AflS能够通过结合AflR调控产毒基因的表达（图6）。因此抑制AflR的作用很可能是槲皮素抑制AFB1产生的核心分子机制，这种机制也与其激活抗氧化系统缓解菌体内氧化胁迫的作用相对应。在AflR下调的情况下，产毒基因的表达会受到抑制。因此槲皮素处理的菌丝的产毒基因全面下调。

4结论

槲皮素处理能够缓解黄曲霉菌的氧化胁迫状态，激活抗氧化系统转录因子Yap1，下调黄曲霉调控基的表达，最终抑制了黄曲霉毒素的产生。因此槲皮素含量可以作为茶叶遭受黄曲霉毒素污染风险评估的重要参数，同时由于其本身的安全性和功能性，可以作为抗毒剂应用于食品行业中黄曲霉毒素污染控制。

作者：王淼焱张浩杨洁胡梁斌莫海珍单位：河南科技学院食品学院西北农林科技大学食品学院信阳茶叶试验站