视神经疾病与能量代谢的关系范文

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《生物化学与生物物理进展杂志》2016年第二期

摘要

神经细胞的特化之一是其轴突，长度可达胞体直径的几百甚至几千倍．轴浆转运维系着胞体和轴突终末之间大量的物质交流，保证神经细胞发挥正常功能．轴浆转运障碍可以导致神经细胞功能受损直至凋亡．在一些视神经疾病中，轴浆转运功能的改变是最早出现的症状，因此也可能成为治疗的潜在靶点．在青光眼和视神经缺血的动物模型中，轴浆转运功能的下降是最早出现的变化之一．而Leber's遗传性视神经病变(LHON)和常染色体显性视神经萎缩(ADOA)是已知线粒体功能障碍引起的视神经疾病．不难想象，长距离轴浆转运功能对能量代谢尤其敏感，因此在LHON和ADOA中可能也有不同程度的下降，但似乎并没有受到足够关注．本文首先回顾了微管和马达蛋白在轴浆转运中的作用，比较分析以上所述几种疾病的发病机制、临床表现及治疗手段，试图发现它们之间的共同特点以及这些特点与能量代谢、轴浆转运之间的潜在关系，为其治疗提供新的思路．

关键词

视神经疾病，青光眼，Leber's遗传性视神经病变，常染色体显性视神经萎缩，能量代谢，轴浆转运

神经元是一种极化细胞，即它具有树突、胞体和轴突．细胞内的物质运输是其进行生命活动的基本功能之一，而神经元轴突相对胞体极大的长度，对细胞器和蛋白质以及其他物质在细胞内的转运形成了一定的挑战．细胞内的物质运输依赖微管和马达蛋白．视网膜神经节细胞是视网膜的输出元件，它的轴突组成视神经，在一些视觉系统疾病中，视神经轴浆转运可能也会是易感环节．在青光眼中，有大量研究表明轴浆转运功能障碍的出现远早于视网膜神经节细胞的死亡．轴浆转运是一个耗能的过程，对青光眼模型的研究表明，轴浆转运障碍可能与线粒体功能受到各种影响而发生异常有关．这使我们联想到Leber's遗传性视神经病变和常染色体显性视神经萎缩这两种已明确的线粒体异常引起的视神经疾病中轴浆转运可能也会发生异常．我们比较分析了这几种疾病的病因、症状及治疗方法，试图发现提高能量代谢水平或重塑轴浆转运功能的方法，为这些疾病的治疗提供新思路．

1轴浆转运

细胞内蛋白质和细胞器的运输是进行生命活动的最基本功能之一，对神经元尤为重要．因为神经元拥有一个独特的结构———轴突，其长度可达胞体直径的几千倍．很多蛋白质和细胞器需要从胞体运输到轴突及其终末，而轴突终末从靶位置摄取的某些物质，也需要运输到胞体发挥作用，有些甚至可以影响细胞存活．细胞的物质运输系统由微管和马达蛋白组成．微管是由13个原丝聚合形成的中空的管状结构，每个原丝都是由结构相似的球蛋白α、β微管蛋白(α-，β-tubulin)异二聚体组合成的．其聚合和水解较快的一端被称为正极，另一端则为负极．正极分布于细胞外周，负极则集中在细胞核附近的中心粒．由于微管蛋白结合的鸟苷酸可以有二磷酸或三磷酸的形式，所以微管蛋白在一定条件下会表现出动态不稳定(dynamicinstability)，即微管蛋白的一端会在延伸和缩短之间转换．在神经细胞的轴突中，微管的排列方向与胞体内是一致的：正极朝向突触终末而负极朝向胞体．微管是轴浆转运的轨道，微管蛋白的翻译后修饰能形成更为稳定的微管结构．Hammond等[1]认为微管的动力学特性主要是由微管蛋白的翻译后修饰等引起．2010年，Janke和Kneussel[2]发现，在成熟稳定的轴突中富含乙酰化的α-tubulin，它们与微管的稳定相关．2012年，Cho等[3]也发现在外周神经系统中的轴突损伤处乙酰化的神经微管蛋白明显减少．

与微管结合的马达蛋白有2种：驱动蛋白(kinesins)家族和动力蛋白(dyneins)家族．驱动蛋白结构与肌球蛋白(myosinⅡ)相似，由2条重链和2条轻链组成．重链的头部是球型马达结构域，尾部由2条重链组成二聚体．驱动蛋白超家族拥有至少10个家族．大多数成员的马达域在N端，向微管的正极运输，而一些成员的马达域在C端，向微管的负极运输．驱动蛋白的运输速度在2～3mm/s．动力蛋白家族则负责向微管的负极运输．轴浆转运中涉及的是胞浆动力蛋白(cytoplasmicdyneins)．它们通常是重链的同二聚体，有2个大的马达域构成的头部，运输速度可达14mm/s．动力蛋白本身就是一个大的蛋白质复合体，在运送细胞器时，它们还需要和另一个大的复合体动力蛋白激活蛋白(dynactin)形成复合体．根据物质运输的速度，轴浆转运可分为快速运输和慢速运输．我们对轴浆转运速度的认识多来自于经典的脉冲追踪术，这种方法用于多种动物的在体研究，发现一部分被标记的蛋白(膜性细胞器和膜蛋白)运动速度较快，为50～200mm/d，细胞骨架蛋白如微管蛋白、神经纤维丝以及成百上千种可溶的或胞浆蛋白如代谢酶、热休克蛋白、马达蛋白等这些蛋白运动速度很慢，为0.2～10mm/d，其中微管蛋白和神经纤维丝速度最慢，为0.2～1mm/d．现普遍认为快速运输是由驱动蛋白和动力蛋白负责的顺向转运和逆向转运组成．慢速转运多为顺向运输，也有极少的逆向转运被报道．最经典的研究是Fink和Gainer[4-5]将轴突中间标记，之后观察到慢速运输向两个方向进行．之后又有动力蛋白参与慢速运输的相关报道[6-7]．一些研究表明，无论是快速运输还是慢速运输，都是由分子马达参与的，之所以后者速度慢，是因为其在运动过程中存在长时间的停顿[8-9].当然，慢速运输的机制比快速运输复杂得多，而且可能不止上述一种[10]．

2视神经疾病及其与轴浆转运障碍的可能关系

视网膜神经节细胞是视网膜的输出元件，以动作电位编码光刺激，通过其轴突，即视神经将其信号传至更高级的视觉中枢．绝大部分的视神经投射至丘脑外侧膝状体，换元后投射至初级视皮层，为成像作贡献．大部分的轴突亦有分支投射至中脑上丘，控制眼动．另有一些节细胞投射至下丘脑、中脑等一些核团，控制瞳孔反射、昼夜节律等非成像视觉功能．视神经病变，如青光眼、Leber's遗传性视神经病变及常染色体视神经萎缩等，它们病程最终的结果都是视网膜神经节细胞退化从而致盲．

2．1青光眼青光眼是仅次于白内障的第二大致盲疾病．青光眼是由主要风险因子眼内压的升高[11]或其他多因素导致的以视乳头凹陷、视盘受损后周边神经纤维层变薄、视网膜神经节细胞退行性病变、视功能进行性损害为主要特点的慢性进展性疾病．青光眼通常被分为开角型青光眼和闭角型青光眼两类．前者起病时并无明显症状，早期患者视力并无明显损害，随着疾病的逐渐发展，视盘周围神经纤维进一步丢失，患者视野表现为进行性缩小，疾病终晚期患者视力丧失．闭角型青光眼则为急性发作，有眼压增高及疼痛．少数患者表现为以视乳头黄斑束最先损害的中心视野缺损．两种类型青光眼最终均可致盲．青光眼病因复杂且尚无定论．转基因动物DBA/2J小鼠中部分动物眼压随年龄上升，较好地模拟了人类开角型青光眼．2008年，Buckingham等[12]的研究表明：3月龄时小鼠眼压上升；6月龄时，轴浆转运荧光金的功能开始下降；12月龄时轴突断裂；18月龄时细胞体固缩，凋亡．Dengler-Crish等[13]在2014年也在DBA/2J的小鼠模型中讨论了轴浆顺向运输和逆向运输障碍发生的关系问题，他们发现在9～10月龄的小鼠中，CTB标记的上丘面积的减少较荧光金标记的节细胞数量的减少更甚，表明轴浆顺向运输障碍要比逆向运输障碍更为严重．在青光眼中，也有多项研究显示与轴浆转运相关的马达蛋白确实出现异常．2006年，Martin等[14]采用了一个激光灼烧房水流出区域造成房水循环受阻的慢性青光眼大鼠模型，他们发现在眼压升高3天后，视神经乳头处72ku的动力蛋白中间链就发生积累．在急性高眼压模型中，将眼压升至较高水平时，荧光金标记的大鼠视神经轴浆的逆向转运功能明显下降[15]，而眼压升至40～50mmHg时，大鼠逆向转运功能先下降，不过在一周后又恢复至正常水平[16]．普遍认为青光眼中视神经乳头是轴浆转运最早发生障碍的部位[17-21]．2011年，Chidlow等[22]发现，在慢性激光灼烧小梁网的慢性青光眼模型中，视神经乳头处蛋白的积累早在模型后8h就已发生，且在24h蛋白的积累达到顶峰．但近来也有研究显示轴突远端先受影响[23]．何士刚实验室长期观察了急性视网膜缺血模型后视网膜神经节细胞轴浆转运功能，轴突连续性及视功能的变化，证实了轴浆转运功能的下降早于轴突连续性的变化，并且轴浆转运功能的下降与视锐度和反差灵敏度测试表征的视功能下降有很强的相关性．我们发现，一旦出现视功能障碍即进行治疗，视功能便可基本恢复至正常状态[15]．这些证据表明，早期的视功能下降，可能包括早期的视野缺失，并非完全是不可逆的．恢复了轴浆转运，就有可能逆转视功能的下降．有研究表明，青光眼的发生及视觉丧失与线粒体功能障碍有关[24-25]．眼内压升高会使视网膜处于供血不足的状态，导致线粒体功能受损[26]．视网膜神经节细胞中的线粒体作为独立的部件，通过轴浆快速转运，从胞体运输至轴突末梢[27-28]．这个过程是由驱动蛋白和微管介导的，需要ATP的参与．在大鼠中，线粒体的生命周期一般为3周[29]．一旦能量代谢异常，会影响线粒体在节细胞中的运输，进而造成恶性循环，更严重地影响能量代谢和轴浆转运．2015年，Takihara等[30]发现：在4月龄的慢性青光眼模型小鼠上，节细胞死亡之前轴浆转运线粒体的数量就已经减少，但线粒体的其他转运指标，如持续时间、转运距离和工作周期等均未发生变化；到23～25月龄时，转运线粒体的时间、距离及工作周期均有下降．青光眼发病和进展随年龄增长而增长，这可能也和线粒体随着年龄的增长所出现的结构和功能的退化相关．比如氧化磷酸化能力减弱、活性氧的产生增加、线粒体DNA的突变增多等等．因为视神经中含有丰富的线粒体，对这些变化可能尤其敏感，而视神经的损害，进而会影响视觉功能[25]．最初治疗青光眼的目标主要是降低眼内压．使眼压下降20%～40%能够将视野缺失的速度减半[31-32].最早降眼压的滴眼液于1875年问世，目前常用的降眼压药物主要为β受体阻断剂、碳酸酐酶抑制剂、前列腺素类似物、α2肾上腺素受体激动剂、拟副交感神经药物等．除了单一成分的滴眼液之外，也存在一些复合制剂．以上这些滴眼液可以减少房水的形成或增加其排出．不过由于青光眼病因不明，也可能是视神经轴浆转运障碍造成的神经营养因子的运输障碍[33]，以致视网膜神经节细胞缺乏神经营养因子(尤其是脑源性营养因子BDNF和神经生长因子NGF)而死亡[34-35]．例如，2000年Pease等[36]发现在急性高眼压的猴子和大鼠的视神经乳头处BDNF及其受体TrkB都有积累．因此，通过直接或基因治疗方式在视网膜中施加神经营养因子，保护神经细胞及改善能量代谢和轴浆转运功能[15,37-38]，可能也不失为治疗青光眼的策略之一．

2．2常染色体显性视神经萎缩(ADOA)常染色体显性视神经萎缩(ADOA)也叫做Kjer's视神经萎缩，因丹麦的眼科医生Kjer发现了19个ADOA家族而得名，其遗传遵循孟德尔遗传法则．随后在英国、美国和法国又有大的家族被报道患有该病．引起ADOA的基因OPA1直到2000年才被发现[39-40]，是由染色体3q28的核DNA编码，而该基因的蛋白质产物靶向线粒体发挥功能，其线粒体损伤致疾病的本质才完全被证明．ADOA在全世界的患病率达3/100000，在丹麦，它的发病率更是高达1/10000[41]．该病发病较早，在儿童时期就已发病．ADOA在发病初期没有明显症状，且多为双侧视神经病变．患者一般会经历缓慢的疾病恶化过程———视力逐渐退化．在个别成人中也有视力急剧下降的报道．眼底检查发现在视盘颞侧有双边对称的白色区域，说明汇聚至视神经轴突的神经纤维确实减少．ADOA视野的丢失从中央开始，ADOA患者还有视敏度下降、色觉受损等症状．有一小部分患者会有一些额外的临床表现，如神经性耳聋、进行性眼外肌麻痹、共济失调和肌肉病变等[42-43]，被称为ADOA+．截至目前，已发现3个与ADOA相关的基因：OPA1、OPA3和OPA7，均编码线粒体内膜上的蛋白．OPA1编码的蛋白是动力蛋白相关的鸟苷三磷酸酶，该蛋白在线粒体融合和细胞色素C的释放中发挥重要作用[44]，并作为一个关键蛋白在线粒体动力学网络中发挥作用．线粒体的动力学是指线粒体沿细胞骨架的运动以及线粒体形态的变化，由融合和分裂控制，其正常进行能保证线粒体正确选择形成管状结构还是网状网络．OPA1基因编码的蛋白能确保内膜的融合，它分布于膜间隙、内膜和线粒体的嵴上，另外，OPA1还能在兴奋性毒性的环境下促进神经元的存活[45]．所以，ADOA是由核DNA突变引起的线粒体动力学障碍致使节细胞死亡视神经萎缩的疾病．2009年，White等[46]发现，在ADOA的小鼠模型中，6月龄的小鼠模型与正常小鼠在视神经轴突形态上并无明显差异，9月龄的小鼠视神经开始出现变性，到24个月时，模型鼠视神经数量比正常小鼠明显减少，此时节细胞层的自噬小体的数量也明显增多．2010年，Heiduschka等[47]用荧光金逆行标记ADOA模型视网膜节细胞，发现20月龄的ADOA小鼠模型视网膜外周和中央节细胞的数量都明显下降．荧光金标记的节细胞减少反映了ADOA模型视神经轴浆转运的逆向运输发生了障碍．但也有研究推测ADOA并非仅由线粒体一个原因所致，OPA1的另一个作用是与嵴相互联系，从而在细胞凋亡中起作用[48]．ADOA的临床表现与开角青光眼比较相似，在发病早期甚至会造成误诊．而开角青光眼患者OPA1基因的表达也可以出现异常[49]．有研究发现，在DBA/2J的慢性青光眼模型视神经乳头处，线粒体融合、嵴的体积等都有异常，且在此处OPA1基因的表达也有所下降[50]．神经元的存活在一定程度上与由线粒体功能决定的能量供给直接相关．2012年，Park等[51]发现在大鼠的青光眼模型中存在自噬小体产生的现象．这些发现表明，ADOA中节细胞的死亡机制与青光眼模型有许多相似之处．对ADOA视神经轴浆转运方面的研究还很少，如果在动物模型上对顺向转运和逆向转运进行详尽的研究，也可能为该疾病的治疗提供线索．目前，ADOA还没有有效的治疗手段．在一个果蝇的ADOA模型中发现增加的活性氧能够影响果蝇的病理学表型[52]，这使抗氧化治疗成为可能的方案．因为ADOA是显性遗传，对患者的基因检测及基因治疗，理论上应该可以获得满意的疗效，但目前尚未见到对ADOA基因治疗的报道．而青光眼和ADOA相似的症状及神经节细胞相似的凋亡机制提示，神经保护及轴浆转运的恢复，可能也不失为治疗ADOA的策略．在凋亡诱导因子(AIF)基因突变的小鼠中，用AAV携带正常的AIF基因进行眼内注射，显示基因治疗后能够减少视神经的萎缩[53]．AIF是核基因，其缺陷也影响到视网膜线粒体功能．所以这项研究，为用基因治疗修复与线粒体功能相关的核基因治疗视神经萎缩，为ADOA可能的干预提供技术路线．

2．3Leber’s遗传性神经病变(LHON)150年前，第一例LHON由vonGraefe报道，而因TheodorLeber于1871年对其进行深入的临床分析而得名．这种遗传的视神经病变在任何一个年龄阶段都会出现，但多数发生在20～40岁之间，且往往双眼都患病．由于在男性青年中多发，一度被认为是伴X染色体遗传．1988年，Wallace和他的同事们[54]发现了第一个LHON相关的线粒体基因的突变———ND4基因，一个编码NADH脱氢酶的基因，此病才被证实是线粒体染色体发生突变的母系遗传．随后，其他的线粒体突变基因也被发现[55-56]．导致LHON最重要的原因是线粒体基因编码涉及电子传递链复合体Ⅰ蛋白的突变．有研究表明，LHON中节细胞的死亡机制可能是细胞凋亡[57]，而离体研究表明这可能是由于ATP供给不足造成葡萄糖的合成困难而引起的[58]．复合体Ⅰ是活性氧的主要来源，LHON可能由于活性氧的增加导致节细胞凋亡．另有研究表明，已有突变的线粒体阻隔Ca2+的能力也有所下降，致使线粒体内Ca2+的浓度增加[59]．这些改变都可能导致神经节细胞的损伤甚至凋亡．LHON病人也会表现出视敏度下降、色觉障碍，严重时，视神经成杯状并萎缩[26]，这可能是因为视神经的乳头黄斑束处纤维更薄更容易受到破坏，也可能是由于能量代谢异常引起轴浆转运功能下降而在视神经上表现出的相似症状．但是，目前似乎并没有关于LHON中轴浆转运功能是否或如何受到影响的报道．不过，线粒体功能障碍可能对轴浆转运有重要影响也不是无端的推测．2000年，Sadun等[60]对两例LHON患者的节细胞死亡及视神经减少的情况进行了分析，发现这两例LHON患者的视神经轴突减少量从95%～99%不等，位于中央的较小直径的轴突损伤最为严重，外围直径大的轴突相对比较完整．当然由于患者年龄、患病时间等因素的不同，不同LHON病人的视神经减少程度也不尽相同．关于治疗LHON的探索一直在持续，但到目前为止还没有十分有效的方法．常规的是化学药物治疗，主要研究有维生素和溴莫尼定．虽然维生素B12不能成功治疗LHON，但它在由LHON维生素B12缺乏引起的视力丧失方面还是能够发挥一定作用的[61-62]．溴莫尼定是一种肾上腺素α2受体激动剂，能够通过上调Bcl-2减少节细胞的死亡[63-64]，但由于受试者招募数量和并未达到减轻视觉损伤的目的，该药在临床试验阶段即被终止[65]．另外还有一些抗氧化的药物，如辅酶Q10和艾地苯醌．辅酶Q10是线粒体电子传递链的一个辅因子．但现在还没有辅酶Q10治疗LHON成功的案例，一个可能的原因是辅酶Q10从磷脂膜往线粒体的传送存在障碍．艾地苯醌是辅酶Q10的衍生物，克服了上述辅酶Q10的缺点．2009年，Eng等[66]的研究显示，7名接受艾地苯醌治疗的LHON患者的视敏度、色觉及视野都有所恢复．LHON最根本的原因是线粒体基因ND4的突变．从目前的情况看，也许可以通过基因治疗根治LHON．2012年Yu等[67]成功地将能够表达线粒体ND4基因的AAV病毒载体注射至LHON小鼠眼中，发现在线粒体中ND4DNA的表达升至80%．Bainbridge等[68]发现，经过基因治疗的患者视敏度在治疗后6～12个月时恢复至最高水平，12个月之后又有所下降，但较未治疗眼仍为明显好转．从上述讨论可以看出，基因治疗对LHON来讲是从最根本致病机理出发的一种治疗方法，也是效果最为显著的一种方法．因为LHON是一个双侧眼均病变的视神经疾病，且发病时间有一定的差别，所以在确诊后对未发病眼的干预，推测可以达到令人满意的疗效．不过，基因治疗后可能的免疫反应会影响其实施，如何用最小剂量的载体病毒表达出最多的ND4蛋白[69]，也是一个亟待解决的问题．

3总结与展望

本文重点讨论了青光眼、ADOA、LHON三种疾病的症状和病因，希望阐释能量代谢和轴浆转运功能障碍对这几种疾病产生的相似影响，提示改善能量代谢和轴浆转运功能，可能成为治疗这几种疾病的共同策略．我们现将上述讨论内容中三者的不同之处总结于表1。青光眼的致病因素比较复杂，不过在慢性和急性眼内压升高的动物模型中，都观察到在神经节细胞受损之前，较早出现的是轴浆转运功能障碍，进而是轴突断裂和细胞凋亡．可能的机制之一是眼内压升高后，视网膜的血供受到影响，从而影响了能量代谢及轴浆转运．相比之下，ADOA的病因非常明确，是由于线粒体相关的核基因突变造成线粒体功能障碍，即能量代谢障碍引起的．其诸多与青光眼相似的症状，被误诊为青光眼的可能，以及少量轴浆转运受损的报道，这些事实在一定程度上说明了2个问题：a．虽然青光眼病因复杂，但可能汇聚的最终通路是能量代谢异常引起的轴浆转运障碍，进而引起神经节细胞凋亡和视功能丧失；b．ADOA的发病早期，可能也存在着轴浆转运的障碍．再对比LHON，病因也非常清晰：线粒体基因的突变引起能量代谢异常．其病情的剧烈恶化，提示线粒体ND4基因与ADOA涉及的OPA1等基因相比，在能量代谢中的作用更为重要，也无法补偿或替代．一旦ND4出现问题并严重到一定程度，节细胞和视功能就会出现灾难性的损害．但少数LHON病人的视功能在一定时间后能有所恢复，也表明至少在这些病人上，视功能的丧失并非不可逆的．对照何士刚实验室在急性眼内压升高模型上的发现，轴浆转运功能和视功能有较高的相关性，而轴浆转运障碍远早于轴突断裂，所以只要在不可逆的损伤出现之前，采取措施维持或恢复轴浆转运功能，就能维持和恢复视功能．而那些视功能有所恢复的LHON患者，可能就是因为其节细胞的能量代谢和轴浆转运功能，尚未进入不可逆的区间，在后期有所稳定和恢复．我们希望通过本文对三种疾病的比较和讨论，提示能量代谢与轴浆转运在这几种疾病中相似的重要作用，从而聚焦改善能量代谢和轴浆转运功能作为治疗这些疾病的共同策略的讨论．

作者：王江华 田国红 何士刚 单位：上海交通大学生物医学工程学院 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院