番茄红素在大鼠肝脏中的几何异构体范文

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《食品科学杂志》2015年第二十四期

摘要：

本项研究的目的是测定大鼠肝脏组织中番茄红素的含量及番茄红素几何异构体（顺/反异构体）的组成，为番茄红素在体内的代谢及生物学功能研究奠定基础。在实验中，选用大鼠为动物模型，用番茄提取物配制灌胃液。一次灌胃8小时后取大鼠肝脏组织，提取其中的番茄红素。应用C30-HPLC-PDA法测定提取物中番茄红素的总量和几何异构体组成。实验结果表明：肝脏中总番茄红素含量为92.95微克/克鲜重。与灌胃液中的番茄红素几何异构体组成比较，肝脏组织中存在更多数量和种类的顺式异构体，包括：13顺-、11顺-、9顺-和5顺-异构体。这一现象对研究番茄红素在肝脏内的贮存、靶向调动和生物学功能研究具有重要意义。

关键词：

番茄红素；几何异构体；肝脏；C30-HPLC；代谢

番茄红素（Lycopene）是一种类胡萝卜素（Carotenoid），由碳氢元素组成。其半系统命名为　　　　胡萝卜素，分子式为C40H56。番茄红素分子由中央多聚烯链和开环末端基团构成。由于其具有高度的不饱和性，番茄红素因此在理论上可形成多种几何异构体。在自然界中番茄红素通常以全反式异构体（AllE-isomer）的形式存在。其分子结构见图1。在自然界中，番茄红素同时还存在着少量顺式异构体（Z-isomer）。最常见的有13-、9-和5-三种单顺式异构体[1]。由于其分子空间结构不同，番茄红素各异构体的生物学功能也有所不同。根据文献报道，在体外抗氧化实验中，全反式异构体的抗氧化性明显优于顺式异构体。但由于顺式异构体在体内溶解性好，生物利用度高，故其在体内的抗氧化性反而高于全反式异构体[2]。

番茄红素具有预防与治疗多种疾病的功能。这方面的研究成果及报道迅速增多，如：防治前列腺增生及癌症[3]、体内抗氧化[4]、抗消化道癌变[5]、降低肺癌风险[6]、抗糖尿病[7]、控制体重[8]等。因此番茄红素也被越来越多地考虑应用在功能性食品中[9]。这些应用推动了对番茄红素在体内吸收、转运和代谢的研究，但目前其相关报道十分有限。已有的报道可概括为：被人体摄入的番茄红素经小肠吸收进入血清，然后被转运到靶器官。其中一部分转运到肝脏中贮存。当靶器官需要时，再从肝脏调出，再经血清转运至靶器官参与代谢反应（如图2所示）[10]。肝脏在这一过程中被认为执行了“库”的功能。因此，研究肝脏中番茄红素的存在形式对探讨其在体内的转运和在靶器官中发生的代谢反应机制具有重要意义。惠伯棣等人已经报道了一次口服番茄红素后雄性大鼠肝脏中番茄红素的积累情况[11]和应用C30-HPLC-PDA分离和检测番茄红素几何异构体的方法[12,13,14,15]。在本项研究中，采用了这一方法对肝脏中的番茄红素几何异构体组成进行了检测。希望这一检测的结果对揭示番茄红素在体内的转运和代谢机理有一定帮助。

1.材料与方法

1.1番茄萃取物果实在本项研究中使用的番茄萃取物由新疆红帆生物科技有限公司提供，该产品为番茄果皮的超临界CO2流体萃取物。其总类胡萝卜素含量为6%（W/W）。其中，番茄红素占94.74%（W/W），　-胡萝卜素占5.26%（W/W）。

1.2试剂番茄红素参比样品（P/N：L9879）购自Sigma公司，番茄红素含量在90-95%范围内。使用前用本项研究中采用的色谱条件检测了其番茄红素几何异构体组成。其全反式异构体的比例大于99%。故使用前未经进一步纯化。萃取用正己烷、甲醇、石油醚（BP：60-90℃）为分析纯试剂，购自北京化工厂。色谱用流动相乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）为色谱纯试剂，购自迪马公司（DickmaTechnologies,USA）。

1.3实验动物SD雄性大鼠购自北京大学医学部实验动物中心，体重350克（±5克）。实验动物合格证号：SCXK京2006-0008。

1.4仪器Multispec-1501型紫外-可见光分光光度计（SHIMADZU，Japan）；HPLC：Waters1525系统配有PDA-2996检测器（Waters，USA）。

1.5灌喂剂量的选择本项研究中选用的番茄红素灌胃剂量参照李京等在番茄红素血清动力学研究中的剂量[16]，为5.25mg/次•只，折合标准体重（50公斤）人体摄入量为150mg/次•人。

1.6灌胃液的配制称取一定量的番茄萃取物完全溶于正己烷中，再混溶于100mL豆油中。在旋转蒸发仪上，在45℃、-0.06MPa、避光条件下将正己烷完全蒸出。用石油醚定量稀释油溶液。在紫外-可见光分光光度计上，在475nm下，比色稀释液。根据下式计算油溶液中番茄红素的浓度[17]。最终，使配制成的番茄红素油溶液浓度为5.25mg/ml。避光保存。操作注意事项：（1）在蒸发正己烷期间应注意严格避光，以避免在加热的状态下油溶液中大量全反式番茄红素发生几何异构化。（2）灌胃液的配制应遵循随用随配的原则。不建议将其放在冰箱中贮存。原因是在4℃条件下番茄红素在油溶液中已形成颗粒结晶，导致灌胃液不均匀和生物利用度的下降。

1.7实验动物灌胃与肝脏收集雄性SD大鼠在动物房中用标准饲料饲养3天。随机分成2组。第一组6只，第二组3只。第一组每只灌胃1mL灌胃液。根据李京等人的报道[20]：摄入番茄红素12小时后，血清中番茄红素水平下降到最低检测限。根据惠伯棣等人的报道[11]，摄入番茄红素8小时后，雄性大鼠肝脏中番茄红素积累水平达到最高值。因此，在本实验中，灌胃8小时后采用股动脉放血法处死大鼠，取肝脏。平均肝重为11.72±0.74克。第二组每只灌胃1mL豆油。灌胃8小时后采用股动脉放血法处死大鼠，取肝脏。平均肝重为11.81±0.24克。

1.8番茄红素的萃取与浓缩本研究中所采用的肝脏中总类胡萝卜素萃取方法参照F.Khachik于1992年报道的方法[21]，并作了相应的优化，以使番茄红素的萃取率提高，降解率最低。在实验中，将大鼠肝脏用组织匀浆器进行破碎后，取4克肝脏匀浆液加入2mL（-20℃）甲醇，振荡30秒，沉淀蛋白。向带有蛋白沉淀的悬浊液中加入3mL正己烷，振荡10min。在4600rpm下离心10min，取上清液2.6mL，用N2吹干至1mL。全程避光，并于冰浴中操作。按上述方法萃取每只大鼠肝脏中的类胡萝卜素，肝脏提取物样品用于HPLC分析前10000rpm离心3min。取上清液进样。

1.9肝脏萃取物的C30-HPLC-PDA分析用于本项研究的C30-HPLC-PDA设备具有良好的稳定性和重现性（RSD<7%）。HPLC条件已由丁靖等人报道[17]，并优化如下：HPLC条件：色谱柱：YMCCarotenoidS-5（4.6×250mm）；流动相A：乙腈-甲醇（3:1,V/V）；流动相B：MTBE；流动相A与B中分别加入0.05%（V/V）三乙胺；线性梯度洗脱：B在8min内由0增加至55%（V/V）；8-40min内B维持在55%；流速：1.0mL/min；检测波长：475nm；PDA光谱收集范围260-600nm；进样量：20　L。对各组分积分得峰面积。

1.10灌胃液的C30-HPLC-PDA分析取0.5mL灌胃液，用正己烷定容至50mL。取1mL定容液，在10000rpm下离心3min。取上清液进样。色谱条件见1.9节。

1.11标准曲线的测定准确（至0.0001克）称取番茄红素参比样品1mg，加入1mL二氯甲烷使其完全溶解，转移至25mL棕色容量瓶中，用石油醚（BP:60～90°C）定容至25mL，配制成40　g/mL的储备液，保存于-20℃冰箱中。使用前用石油醚配制6个不同质量浓度的工作液。分别进样，在C30-HPLC上测定全反式番茄红素组分含量与其色谱峰面积的相关关系，得到浓度-峰面积线性回归曲线和方程，R2为0.996。

1.12各番茄红素几何异构体组分的定性与定量根据组分的色谱行为和光谱特征对番茄红素几何异构体进行鉴定。对各组分在色谱图上峰面积和浓度-峰面积线性回归方程，计算各组分的质量浓度。根据李京等人的报道[22]，虽然番茄红素顺式异构体的吸光系数与全反式异构体的不同，但这一结果尚未经其他实验室证实。因此，在本项研究中时，依旧根据全反式异构体的吸光系数计算顺式异构体的含量。

2.结果与分析

2.1灌胃液中类胡萝卜素组分的分离由新疆红帆生物科技有限公司提供的番茄红素萃取物为番茄果皮的超临界CO2萃取物，该萃取物中所含主要类胡萝卜素为番茄红素，此外，还含有少量的　-胡萝卜素。其中除全反式番茄红素外，还含有少量的顺式番茄红素。图3为这一萃取物的C30-HPLC-PDA色谱图。组分I的保留时间与番茄红素全反式异构体参比样品的保留时间一致。

2.2肝脏萃取物中类胡萝卜素组分的分离根据惠伯棣等人的报道[11]，灌胃8小时后，雄性大鼠肝脏中番茄红素的积累量达到最高水平。因此，在本项研究中，在灌胃8小时后，摘除大鼠肝脏，取4克肝组织，萃取其中的类胡萝卜素，用C30-HPLC-PDA，分离其中的类胡萝卜素组分。图4为灌胃8小时后肝脏萃取物的C30-HPLC色谱图。组分I的保留时间与番茄红素全反式异构体参比样品的保留时间一致。

2.3各组分电子吸收光谱特征比较使用HPLC上配备的PDA检测器，可在线采集各组分的电子吸收光谱。图5为组分I、II、III、IV和V的电子吸收光谱比较。表1为各组分电子吸收光谱特征比较。从表中可以看出，五个组分的主吸收带最大吸收波长发生了7nm的变化。顺式峰最大吸收波长（362nm）未见明显变化。

2.4灌胃液与肝脏提取物中番茄红素几何异构体的定性根据各组分的色谱行为和光谱特征对各组分定性。定性结果认为I、II、III、IV、V和VI分别为全反式-番茄红素、5顺-番茄红素、9顺-番茄红素、11顺-番茄红素、13顺-番茄红素和　-胡萝卜素，其中除了组分IV未得到质谱数据支持，其它均有参考文献支持。图6为各顺式异构体的分子结构。

2.5灌胃液与肝萃取物中番茄红素几何异构体的定量表2为各异构体组分的含量。从表2可以看出：在灌胃液中，番茄红素以全反式异构体为主存在形式，此外还含有少量的11-顺式异构体，其它种类异构体比例极低。与灌胃液中的情况相比，肝脏中含有大量的番茄红素顺式异构体，包括：13-顺式异构体、11-顺式异构体、9-顺式异构体和5-顺式异构体。换言之，从肝脏检出的番茄红素组分中，顺式异构体比例明显上升，总顺式异构体比例超过60%。同时，全反式番茄红素比例下降。

3.讨论

全反式番茄红素在肝脏中以大量顺式异构体形态存在的现象在国内外文献中未见报道。这一现象的发现可能对番茄红素生物学功能和在体内代谢的研究产生重要的影响。根据李京等人的报道[20]，番茄红素在血中的存在形式就包括大量的顺式异构体。因此，来自消化道的全反式异构体发生顺式异构化的位置应该不在肝脏中。此外，由于不同异构体在体内的溶解性和抗氧化能力均有所不同[23]，可以设想在肝脏内中存在的顺式异构体具有不同于全反式异构体的生物学功能。当体内靶器官需要调动贮存在肝脏内的番茄红素时，肝脏中的各种几何异构体以何种形态和数量再度进入血液是非常有价值进行探讨的问题。上述问题的探讨将有助于推动番茄红素在体内的代谢和生物功能研究的进一步发展。

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作者：惠伯棣 冯润月 宫平 单位：北京联合大学应用文理学院食品科学系