食品工业中应用的研究范文

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1传统方法获得GOD

1.1菌株诱变对GOD生产菌株的诱变通常采用紫外诱变和化学诱变剂诱变等方法。紫外线照射通过改变菌体DNA从而引起菌体的突变。李筱瑜等人将黑曲霉菌株P－9采用紫外线进行诱变，得到突变菌株U－69产酶酶活是出发菌株P－9的2.5倍。化学诱变是用化学诱变剂处理菌种，以诱发遗传物质的突变。化学诱变相比于紫外诱变更具定向性，化学诱变剂不同，作用的菌株、细胞及基因不同，诱变的效果也会存在差异。常用的化学诱变剂有甲基磺酸乙酯(EMS)和硫酸二乙酯(DES)等。选择单独一种诱变方法，也可以几种方法复合使用，筛选出其中的正突变菌株，提高原始菌株产酶能力。

1.2微生物产GOD的主要影响因素通过筛选得到高产GOD的天然菌株或者通过诱变育种获得高产的突变菌株，同时适宜菌株生长的培养条件及合适的培养基组成也是高效生产微生物GOD的关键因素。发酵条件的优化能进一步提高菌株的产酶活力。文献中适宜微生物产GOD的条件见表2。从表2可以看出，不同的菌种对碳源有显著的选择性。一般生产中选择葡萄糖作为产GOD菌株的碳源，Hatziuikolaou等报道，葡萄糖是GOD最主要的诱导物，另有一些霉菌在以蔗糖、糖浆、甘露糖、果糖等作为碳源时也能产生GOD。研究表明，初始碳源浓度为8%左右时适宜GOD的合成。浓度降低，菌体生长缓慢，使产酶下降;而浓度继续增大，由于其分解代谢物大量生成形成阻遏作用，产酶水平也会降低。而在氮源的选择上，有研究表明，硝酸盐比蛋白胨等有机氮源对产酶的促进效果更好。郭晓贤等的研究结果表明，将硝酸盐和蛋白胨复配作为复合氮源相比于单一氮源更有利于GOD的生成。

培养基初始pH对酶活力有很大的影响，pH值的选择在GOD的生产中是一个关键的因素。GOD在pH56之间活力较高，在接近5.5时酶活力最高;pH值低于4.5，或超过6.5时酶活均有显著下降趋势。GOD在强酸强碱环境中活力容易降低的原因可能是由于酶蛋白活性中心氨基酸残基随着pH值的变化而发生了改变，使得酶蛋白结构发生变化而丧失活性。在现实环境下，最适pH值不一定是一个固定值，随着底物、缓冲液的不同而相应地发生变化。一般来说葡萄糖氧化酶在pH56时有较好的稳定性。在微生物的生长和GOD的合成过程中，温度影响很大，一般认为30℃31℃为黑曲霉的最适发酵温度。在发酵培养前期将温度控制在略高于30℃，使菌丝体生长旺盛，之后温度降至30℃31℃培养，产酶量将有很大程度的增长，因为产酶需要相对较低的温度。青霉菌生产GOD的适宜温度比黑曲霉略低，一般在26℃29℃。

产酶活性最初随时间的增加而增大，达到最大值后随时间的增加而逐步降低。因为初始阶段微生物生长迅速，处于对数生长期，产酶逐渐增加。随着微生物继续生长繁殖，代谢产物逐渐增多，尤其是酸的大量生成使pH值迅速下降，不利于产酶。不同菌种生长周期不同，因此根据不同的菌种选择合适的发酵时间有利于GOD的生产。在菌株培养产酶的过程中，只有当溶氧满足菌体的需求时，菌体才能正常的生长及产酶。当达到一定转速，溶氧量已经可满足菌体生长和产酶的需求时，酶活不会出现明显增加的现象。在实验室发酵试验中，搅拌转速一般选择在200r/min左右。在GOD的合成过程中，低浓度的钙离子对GOD的产生有促进作用，当超过一定浓度之后反而抑制产酶。经试验发现，以35g/L的浓度添加CaCO3对产酶的促进作用最明显，而Mg2+、Fe2+在GOD的合成过程中起到抑制作用。

2利用基因重组技术获得GOD

工业化生产中常用黑曲霉或青霉发酵来获得GOD，但黑曲霉和青霉菌发酵过程中常会伴随产生过氧化氢酶、淀粉酶等其他杂蛋白，给后期的分离纯化工作带来困难，使用基因工程菌重组表达葡萄糖氧化酶基因有利于解决这一问题。将GOD的基因进行克隆，连接相应的表达载体后转化基因工程菌株，通过诱导表达GOD基因来获取大量的GOD蛋白。由于基因工程菌株分泌到基质中的其本身内源蛋白量很少，基质中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能简化后期的蛋白纯化操作。目前国外主要用基因克隆、表达来提高菌株的产酶活力，在这一领域研究已经比较深入。WhittingtonH成功地将青霉菌的GOD基因导入到酿酒酵母中，获得了具有生物活性的GOD;Szynol实现了GOD基因在大肠杆菌中的表达;SilviaCrognale将一株青霉的GOD基因成功导入到毕赤酵母中，发酵培养酶活达到50U/mL;国内在这一方面的研究也取得了一定的进展。母敬郁等采用瑞氏木霉表达了黑曲霉来源的GOD基因，经过对重组后的瑞氏木霉进行诱变筛选，突变株的GOD发酵液酶活达到25U/mL。目前已有多种外源基因表达系统被开发出来，如大肠杆菌表达系统、酵母表达系统等。大肠杆菌表达系统虽然发展较为成熟，操作简单、周期短、产量高，但其表达产物无翻译后的修饰与加工过程，不能对蛋白质进行翻译。酵母繁殖速度快、易于培养、基因工程操作简便，并能够对目的蛋白进行翻译后加工与修饰，越来越广泛地用作外源基因表达的宿主菌株。常用的酵母表达系统主要有酿酒酵母(Sac-charomycesceresiviae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapasloris)表达系统。酿酒酵母表达系统由于存在表达产物产量低、分泌效果差，不适合高密度发酵等缺点在实际应用中有一定的局限性。巴斯德毕赤酵母表达系统外源基因表达量高且稳定、培养成本低，且适合于高密度发酵，便于实现工业化生产。同时分泌到细胞外的自身蛋白量少，有利于外源蛋白后期的分离纯化，因此被广泛地应用于外源基因的表达。

毕赤酵母发酵生产外源蛋白一般过程包括:首先基因工程菌株在生长培养基中富集培养达到一定的生物量，然后以甲醇为诱导物诱导产酶。前一阶段并不诱导产酶，只是菌体富集的阶段;后一阶段在甲醇的诱导下，毕赤酵母甲醇氧化酶AOX1基因才能启动和表达，此时才诱导产酶。在优化工程菌株的发酵条件时，除了控制温度、pH值、溶氧等常规条件外，甲醇作为诱导过程中唯一的碳源和诱导物是影响表达效果的关键因素，其诱导方式、浓度、诱导时间都会产生影响外源蛋白的表达。既要保证甲醇浓度能够满足毕赤酵母表达代谢所需要的碳源和能量，同时甲醇浓度过高会产生过量的过氧化氢及甲醛，对细胞造成毒害，因此严格控制甲醇浓度是提高毕赤酵母表达量的重要因素。虽然目前利用基因工程的手段实现了GOD的异源表达，但是由于表达量不高导致的生产成本高的问题仍然没有得到有效的解决，阻碍了GOD的大规模工业化生产及应用。因此如何采用基因工程技术实现GOD基因的高效表达，使GOD的产量得到大幅度的提高成为了亟待解决的关键问题。

作者：朱运平伍少明李秀婷肖林滕超褚文丹单位：北京工商大学食品学院食品添加剂与配料北京高校工程研究中心北京市食品风味化学重点实验室山东龙力生物科技股份有限公司