色谱分析法在生物科学研究中的实践范文

本站小编为你精心准备了色谱分析法在生物科学研究中的实践参考范文，愿这些范文能点燃您思维的火花，激发您的写作灵感。欢迎深入阅读并收藏。

1氨基酸分析

1．1液质联用技术液质联用技术将高效液相色谱仪与质谱仪联接起来使用，即把色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的强定性能力结合起来，在氨基酸分析中得到了广泛的应用。与一般的液相色谱法相比，液—质联用技术不但可分离各种氨基酸，而且可以对未知的氨基酸成分进行鉴定;由于使用质谱仪作为检测部件，还可以不用对样品进行衍生。王萍等采用高效液相色谱—电喷雾质谱法鉴定出了青稞幼苗提取物中的13种氨基酸，证明是一种理想的全谱氨基酸分析方法。Maoetal也利用液质联用技术测定了生物样品中6种硒代氨基酸。此外，串联质谱技术在氨基酸分析中的应用也受到了关注。汤新星等基于高效液相色谱—电喷雾串联质谱及固相萃取技术，建立了分析大鼠血浆中氨基酸的方法，为筛选新的急性辐射损伤标记物提供了实验依据。

1．2气质联用技术氨基酸也可通过气相色谱法进行分离，但氨基酸沸点高，必须通过衍生化处理成为低沸点、易气化的化合物，再利用试样中各组分在两相间的分配系数不同进行分析。目前最常用气质联用技术对氨基酸进行检测。王建等利用盐酸把菌体蛋白水解成氨基酸，再通过分离、浓缩、真空干燥、N-(叔丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺衍生化后得到的衍生物进行气相色谱分离和质谱法检测，获得了15种菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。李长田等采用气相色谱—质谱法测定了松茸子实体和液体发酵菌丝体氨基酸等物质，结果表明，松茸子实体和发酵菌丝体二者氨基酸的种类相同，但发酵菌丝体中某些氨基酸的含量高于子实体中的含量。Mudiametal则首次应用固相微萃取—气质联用技术测定了尿液和毛发中的20种氨基酸，在分离前采用氯代甲酸乙酯对氨基酸进行柱前衍生化处理，该方法灵敏、快速。

1．3超高效液相色谱技术超高效液相色谱技术是色谱分析技术的最新发展成果之一，与常规高效液相色谱相比，最主要的差别是采用了超微细度的固定相颗粒，因而单位柱长的柱效大大提高，实际使用中就可用更短的色谱柱达到常规色谱柱的分离效果，使得整个分析时间大大缩短。该技术已应用于许多样品中氨基酸成分的分析［1，15，19］。孙言春等利用超高效液相色谱法测定了史氏鲟、达氏鳇和小体鲟卵中17种氨基酸的含量，完成一次分析仅需10min。超高效液相色谱法还被应用于快速分析和鉴定3种生菜中的氨基酸，并发现了10种由已知氨基酸和倍半萜内酯所形成的新结构单元，为生菜等植物所具有的潜在生物活性找到科学依据。

2蛋白质分析

蛋白质是生命的物质基础，几乎参与生命活动的每一环节，在机体的生长、发育、代谢、衰老等过程中发挥重要作用。但蛋白质种类很多，在分子量大小、带电性、分子结构和生物特异性等方面均有很大差异。因此在分离模式、定量和定性方法上都有很大差别。根据分离原理的不同，用于蛋白质测定的液相色谱法主要可分为反相色谱法、排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法和逆流色谱法等。此外，还包括基于色谱分离技术和检测技术等发展而来的液质联用技术、多维液相色谱法和超高效液相色谱法等。目前用于生物样品中蛋白质检测的主要方法及其典型应用见表2。

2．1反相色谱法反相色谱法主要利用被测组分对极性流动相和非极性固定相的作用力不同加以分离。这种分离系统在液相色谱分离模式中使用最为广泛。对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，反相液相色谱正受到越来越多的关注。Silvaetal采用反相色谱—质谱技术分离测定了人血清中的11种常规蛋白的浓度;王娟等采用AgilentZorbax300SB-C8色谱柱，建立了测定牛奶中主要蛋白质(4种酪蛋白与乳清蛋白)的反相高效液相色谱法，在波长214nm处对分离后的蛋白质进行紫外检测。于海洋等则用纳升级反相液相色谱—串联质谱系统分析了锦灯笼果实提取物中蛋白质的酶解产物，鉴定得到60种蛋白质，其中与抗氧化相关的蛋白质有3种。

2．2排阻色谱法排阻色谱法是根据被测组分在固定相中的渗透能力不同而分离的。这种色谱法采用多孔性凝胶为固定相，较小的分子较易被保留，因而是依照分子量的大小顺序出峰。生物体中各种蛋白质分子量常常差异很大，很适合用排阻色谱法进行分离。利用排阻色谱法将溶液中的蛋白质按照分子量大小进行分离，再配合特征波长的紫外检测器，可有效地将目的蛋白捕获并测定。Bondetal借助排阻色谱技术，并配合双波长紫外检测，研究了在不同环境条件下IgG1单克隆抗体的含量水平及聚合降解等特性。重组人白介素-1受体拮抗剂蛋白的测定也可采用这种方法，在0．018－2．4mg•mL－1范围内，该方法的线性关系良好，回收率为99．1%，相对标准偏差为1．09%。

2．3离子交换色谱法离子交换色谱法主要是利用蛋白质在pH值高于或低于等电点时可分别带负电荷和正电荷的特点而进行分离。不同蛋白质组分离子对作为固定相的离子交换剂的交换能力不同，保留时间也不同。在大孔硅胶表面通过聚合键入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵制得的强阴离子交换色谱填料，可用于鸡蛋中卵清蛋白的分离纯化，所需时间在20min之内。隋少卉等则用强阳离子交换色谱分离了肝癌细胞中磷酸化蛋白，并与等电聚焦技术进行比较，结果表明，在分离效果方面前者优于后者，但在定量分析的稳定性方面，后者则优于前者。在多维色谱分离系统中，离子交换色谱常被作为第一维，以实现对蛋白质混合物的预分离。

2．4液质联用技术蛋白质在紫外区有吸收，因此在分离之后可以不经衍生直接用紫外检测器测定，但紫外检测器对蛋白质的鉴定能力差。液质联用法兼具强分离和强定性能力，而且灵敏度高，更适合于复杂蛋白质的分析。各种类型的色谱分析法都可与质谱法联用，实现对蛋白质的高效分析。这种色质联用技术已用于毛白杨次生维管系统蛋白、人体肠组织运输蛋白和晶状体蛋白等的分析测定。

2．5多维高效液相色谱法多维高效液相色谱法是利用两根或多根性质不同的色谱柱，通过一定的接口和切换技术进行不同色谱分离模式的组合，完成对复杂样品中待分析组分的分离。与一维液相色谱相比，多维液相分离系统具有更高的峰容量和分离能力，因而已在蛋白质分析和蛋白质组学研究中得到越来越多的应用。其中，离子交换色谱—反相高效液相色谱是最常用的分离系统。血浆中高丰度蛋白质的存在严重干扰低丰度蛋白质的检测，利用强阴离子交换色谱—反相高效液相色谱二维液相色谱技术，可使血浆蛋白质得到充分分离，再借助串联质谱对血浆中的高丰度蛋白质进行色谱定位并去除。

2．6超高效液相色谱技术超高效液相色谱技术已用于大鼠肝组织、人体膜组织蛋白及奶粉等生物样品中蛋白质的快速检测。Jietal建立了超高效液相色谱—多反应监测串联质谱法，可同时测定3种人细胞膜运输蛋白，线性范围为0．2－20μg•mL－1，精密度和准确度均可控制在15%以下，为膜蛋白在人体内外表达的研究提供帮助。Zhangetal把超高效液相色谱—串联质谱法应用于婴幼儿配方奶粉和乳清蛋白浓缩物中牛乳清蛋白含量的测定，该方法的回收率、重现性和检出限均符合实际样品测定的要求。

3小结

综上所述，色谱分析技术可应用于不同生物样品中各种氨基酸和蛋白质的含量分析和组成鉴定。色谱分析技术已从较简单的气相色谱和液相色谱技术，发展到色谱—质谱联用技术，再到多维色谱技术和超高效液相色谱技术等等。随着科技的进步和生物科学研究的不断深入，将会有更多符合实际需要的新色谱技术出现，可为氨基酸和蛋白质的分析寻找到更加理想的分离检测模式。

作者：张舒欢周碧青单位：福建农林大学生命科学学院福建农林大学测试中心