他克莫司在大鼠体内短链脂肪酸的影响范文

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《兽类学报》2018年第1期

【摘要】目的探讨使用他克莫司（FK506）的大鼠体内短链脂肪酸（SCFA）的变化及其对血糖水平的影响。方法将10只SD大鼠分为FK506组和对照组，每组各5只。FK506组给予每日皮下注射FK506（3mg/kg）+含10%乙醇的葵花油溶液，持续4周；对照组给予皮下注射等量的含10%乙醇的葵花油溶液，持续4周。给药期间每周测量2组大鼠体质量。给药结束后，检测两组大鼠的血糖水平、血液和粪便中的SCFA含量。结果与对照组比较，第2、3、4周FK506组大鼠的相对体质量均降低，差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组比较，FK506组大鼠在给予葡萄糖后0、30、60min时血糖水平均升高，差异均有统计学意义（P<0.01～0.05）。与对照组比较，FK506组大鼠粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸含量均降低，差异均有统计学意义（P<0.01～0.05）。结论FK506可导致大鼠血糖水平升高，这种升血糖的作用可能由大鼠粪便SCFA含量降低引起。

【关键词】大鼠；他克莫司；血糖；短链脂肪酸；体质量；移植术后糖尿病；肠道菌群

移植术后糖尿病（post-transplantdiabetesmellitus,PTDM）是实体器官移植术后的重要并发症，肾移植术后1年内PTDM的发生率约为30%～50%，可明显影响移植物的存活[1]。除肥胖、家族遗传史等因素外，肾移植术后长期使用免疫抑制剂也是导致PTDM发生的主要原因[2-4]。Karlsson等[5]研究发现，糖尿病患者与非糖尿病患者的肠道菌群有差异，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者肠道菌群的厚壁菌门菌明显减少。越来越多的研究也表明，肠道菌群可通过代谢产物短链脂肪酸（shortchainfattyacids，SCFA）来影响血糖代谢[6-8]。目前，关于肾移植受体术后服用他克莫司（FK506）与受体体内SCFA变化的相关研究较少。本研究分析注射FK506大鼠的体内SCFA和血糖的变化，旨在探讨FK506对SCFA和血糖代谢的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雄性SD大鼠10只，周龄6～7周，体质量200～250g，购自成都达硕实验动物有限公司。购入后饲养于四川大学华西医院实验动物中心，环境符合清洁级标准，用标准大鼠饲料喂养，自由饮水。动物实验取得四川大学实验动物伦理委员会审批同意。

1.2主要试剂和仪器

FK506购自杭州中美华东制药有限公司，10%葡萄糖注射液购自四川科伦药业股份有限公司，乙醚购自成都国药集团西南医药有限公司，电子秤、血糖检测仪购自长沙三诺生物传感股份有限公司，气相色谱–质谱法联用仪（gaschromatography–massspectrometry，GC-MS）购自美国ThermoFisherScientific公司。

1.3实验分组与干预方法

将10只大鼠分为FK506组和对照组，每组各5只。FK506组：FK506（3mg/kg）+含10%乙醇的葵花油溶液每日皮下注射，持续4周。对照组：等量含10%乙醇的葵花油溶液皮下注射，持续4周。

1.4检测指标

1.4.1体质量及血糖水平监测

给药期间每周测量2组大鼠体质量（相对体质量＝该周体质量/给药前体质量）。2组大鼠给药4周结束后禁食过夜，第2日早上再次给药，2h后腹腔注射1mg/kg的葡萄糖溶液，分别在0、30、60、90、120min尾静脉采血，血糖检测仪检测样本中的血糖水平。

1.4.2SCFA含量检测

血液样品（100μL）加入1mL乙醚萃取15min，低温离心分离（22000×g，10min，4℃），取乙醚相进样分析。粪便样品（1g）加入3mL盐酸水溶液，均质机上均质5min，然后离心分离取上清液，加入1mL乙醚萃取15min，低温离心分离（22000×g，10min，4℃），取乙醚相进样分析，使用GC-MS仪进行定量测定SCFA。1.5统计学方法采用SPSS16.0软件进行统计学分析。所有数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，组内前后比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组大鼠相对体质量和血糖的比较

两组大鼠给药期间的相对体质量变化见图1。对照组大鼠第2、3、4周的相对体质量明显高于第1周（均为P<0.01），而FK506组大鼠第3、4周的相对体质量明显低于第1周（P<0.01～0.05）。与对照组比较，第2、3、4周FK506组大鼠的相对体质量均降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。两组大鼠给药4周后血糖水平变化见图2。注射葡萄糖后0、30、60min时，FK506组大鼠的血糖水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01～0.05），注射葡萄糖后90、120min时，两组的血糖水平比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。

2.2两组大鼠体内SCFA含量的比较

两组大鼠血液样本中SCFA变化见图3。与对照组比较，FK506组大鼠血液中丁酸、异戊酸和戊酸含量略有升高，但差异均无统计学意义（均为P>0.05）。对照组大鼠血液中未检测出甲酸、乙酸、丙酸和异丁酸（即在检测临界值下），FK506组大鼠血液样本中未检测出甲酸，仅有1只大鼠血液中检测出乙酸、丙酸和异丁酸。两组大鼠粪便样本中SCFA变化见图4。与对照组比较，FK506组大鼠粪便中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸含量均降低，差异均有统计学意义（P<0.01～0.05）。对照组和FK506组大鼠粪便中未检出甲酸。以上结果表明，FK506给药后大鼠粪便中SCFA含量明显降低。

3讨论

肾移植受体术后长期联合使用钙神经蛋白抑制剂（CNI）+吗替麦考酚酯（MMF）+肾上腺皮质激素的免疫抑制方案是PTDM的主要危险因素，CNI中的FK506较环孢素（CsA）更易导致PTDM发生[2,9-10]。Gnatta等[3]发现服用FK506的肾移植受体的PTDM发生率为24.6%，而服用CsA的肾移植受体则为17.2%。肠道中的SCFA主要由远端结肠细菌发酵粗纤维食物产生，通过结肠上皮细胞表面表达的单羧酸转运蛋白Ⅰ和钠耦合单羧酸转运蛋白Ⅰ转运进入血液循环，可直接影响外周组织的代谢和功能[11-12]。SCFA中90%～95%为乙酸、丙酸和丁酸，可参与糖代谢并预防胰岛素抵抗，其中乙酸是胆固醇合成的底物，可通过中枢下丘脑机制抑制食欲，丙酸是蛋白质、糖、脂肪合成的前体，丁酸是结肠上皮的主要能量来源[13-15]。Fernandes等[16]对正常对照和高胰岛素血症的受试者静脉注射乙酸，发现乙酸可使体内游离脂肪酸下降，且游离脂肪酸的下降水平与胰岛素抵抗水平呈负相关，表明乙酸可减少脂类分解并改善胰岛素抵抗。Perry等[17]发现乙酸可通过激活副交感神经，从而促进胰岛素和生长激素的分泌。SCFA对于血糖的调节具有明确的作用，但FK506对移植受体血糖水平的影响是否与SCFA有关仍不清楚。当糖尿病患者的胰岛素分泌减少或产生胰岛素抵抗时，机体糖利用率下降，而脂肪、蛋白利用率升高，可致体质量下降[18]。本研究报道了大鼠注射FK506后体质量、血糖水平以及体内SCFA含量的变化。我们发现大鼠服用FK506后，与对照组比较，FK506组大鼠的相对体质量显著降低，血糖水平显著升高，粪便中的SCFA显著降低，提示FK506导致血糖水平的升高可能由粪便SCFA含量降低引起。而FK506组和对照组大鼠血液中SCFA含量则无显著差异，可能与FK506主要影响肠道菌群相关。本研究仍有一定局限性。首先，粪便SCFA大部分由肠道菌群分解产生，研究未对大鼠各类肠道菌群进行观察；其次，大鼠饮食及肠道菌群与人类的差异，以及临床肾移植受体同时服用其他免疫抑制剂的偏倚，导致此研究结果不能直接转化至临床，仍需进一步的实验加以验证。综上所述，FK506可导致大鼠血糖水平升高，这种升血糖的作用可能由大鼠粪便SCFA含量降低引起。

作者：黄中力；蒋亚梅；宋涂润；王显丁；范钰；刘金鹏；王志灵；王莉；林涛